文献情報
文献番号
199900201A
報告書区分
総括
研究課題名
心血管作動性因子と成人病及び老化に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
寒川 賢治(国立循環器病センター研究所)
研究分担者(所属機関)
- 中尾一和(京都大学医学部)
- 木村定雄(千葉大学医学部)
- 宮本 薫(福井医科大学)
- 平田恭信(東京大学医学部)
- 南野直人(国立循環器病センター研究所)
- 中里雅光(宮崎医科大学)
- 小室一成(東京大学医学部)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 長寿科学総合研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
29,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
生体機能の老化を考える上で心血管系は最も重要な器官であり、その機能の低下や異常は種々の成人病や老化の進展に深く関わる。近年、心血管作動性因子、特にアンジオテンシンⅡ、Na利尿ペプチド、エンドセリンなどのペプチド性因子とその受容体に関する生化学的、分子生物学的研究が大きく展開し、その全体像が明らかにされつつある。さらに最近我々が発見した新しい心血管作動性因子、アドレノメデュリン(AM)と関連ペプチド(PAMP)も、心疾患、高血圧や動脈硬化などの血管代謝障害に深く関与すると考えられている。本研究では、上記因子とそれらの受容体による心血管系の機能制御のメカニズムの解明と、そのバランスの乱れや異常による成人病の発症や老化進展について、分子生物学、発生工学的手法を中心に用いて解明すると共に、新しい診断、治療法開発への応用を目指した。
研究方法
本年度は、アドレノメデュリン(AM)をはじめとして、アンジオテンシンⅡ, Na利尿ペプチド,エンドセリン,グアニリンとそれらの受容体及びHDL受容体;SR-BIについて、発現調節、機能解析、病態生理的意義の検討を行い、これらの成人病の病態と老化への関与を探った。尚、本研究においてヒトを対象とした研究は、各研究施設で定められた臨床研究の規定に従い、実験動物を用いた研究では、実験動物飼養及び保管に関する基準、各研究施設における実験動物委員会の指針に基づいて行った。
結果と考察
1)アドレノメデュリン(AM)の発現調節、機能解析及び病態生理的意義:AMは生体内の多くの細胞から分泌され、その産生及び機能の異常は成人病と深く関連すると考えられる。間質系細胞の産生するAMの機能を検討し、炎症反応や成人病との関連を探った。特異的受容体を発現するSwiss3T3線維芽細胞を用いて、炎症性サイトカインのTNF-α産生を検討したところ、AMは基礎分泌量を変化させないがIL-1β刺激により亢進したTNF-α産生を迅速かつ強力に抑制した。また、全身性炎症反応症候群(SIRS)の血中AM濃度と炎症反応との関連を検討したところ、敗血症性ショックなどを含め症状の重篤度との間に正相関が認められ、診断指標に使用できる可能性が示された。この結果、AMは間質組織を含め炎症反応に相関して産生が亢進し、分泌されたAMは抑制的に機能していると考えられた。一方、AMは心血管系の保全に役割を担う循環調節因子であり、心血管の老化の制御にも深く関与すると考えられる。AMの機能解析の一環として、マウスAM受容体構成蛋白質のcDNAクローニングを行うとともに、敗血症の病態モデルにおける発現解析を行い、その生理的意義を検討した。複雑な敗血症性ショックの病態において、AM遺伝子発現とともに受容体の発現変化もAMの生理作用に強く影響を与える可能性が示唆された。
2)ナトリウム利尿ペプチド(BNPおよびCNP)の臨床診断的意義の検討と治療への応用:ナトリウム利尿ペプチドの成人病及び老化における病態生理的意義と臨床応用への可能性を明らかにするため、BNPノックアウトマウスにおける腹部大動脈縮窄の影響を検討した。BNPノックアウトマウスでは心室肥大とともに心筋線維化の明らかな増悪が認められ、BNPは心室圧負荷に対して迅速に反応し、心筋線維化を抑制することが明らかになった。又、CNPの骨軟骨形成因子としての意義を明らかにするために、成長板軟骨でCNPを発現するトランスジェニックマウスを作製した。内軟骨性骨化の促進を伴う著しい体幹及び四肢の伸長が認められ、CNPが骨軟骨局所で内軟骨性骨化促進因子として作用することが明らかになった。
3)心血管系における2種類のエンドセリン受容体発現のスイッチ機構と動脈硬化:G蛋白質共役受容体キナーゼ2(GRK2)による受容体シグナルのリン酸化非依存性の抑制機序の解明を目指し、GRK2変異体の機能を解析した。ET-1とアンジオテンシン(AT)Ⅱに対する細胞内Ca応答を解析すると、GRK2やキナーゼ不活性のGRK2-K220Wだけでなく、キナーゼ・PHドメイン欠損体GRK2(1-181)、GRK2(54-174)でもCa応答の強い抑制を認めた。一方、全長GRK2、GRK2(1-181)は選択的にGqと結合し、Gi/o, Gsとは結合しなかった。以上より、GRK2のN末端部の新しいRGSドメイン(54-174)がGqに結合して受容体シグナルを抑制するリン酸化非依存の機序が示唆された。
4)動脈硬化の発症、進行における内因性血管作動物質の病態生理的役割の検討:アドレノメデュリン(AM)は血管緊張の調節ばかりでなく細胞増殖や分化の調節にも関与することから、AMの内皮細胞のアポトーシスに及ぼす影響を検討した。ヒト臍帯静脈の内皮細胞は血清除去培地で培養するとアポトーシスを生ずる。AM投与は用量依存的に核濃縮及び細胞死を減少させた。cAMPアナログや細胞内cAMP増加作用物質には抗アポトーシス作用は見られなかったが、L-NAMEの存在下ではAMのこの作用は抑制された。1～10μMのSNPによる抗アポトーシス作用は可溶性グアニリルシクラーゼの阻害や8-br-cGMPの存在で変化しなかった。AMおよびNOは内皮細胞のアポトーシスをcGMP非依存性に抑制すると考えられる。
5)心臓リモデリングにおけるアンジオテンシン(AT)Ⅱの役割:アドリアマイシンは心毒性を示し心筋症を誘導するがその機序は不明である。アドリアマイシン心筋症発症におけるATⅡの役割について、ATⅡ1型受容体ノックアウトマウスを用いて解析した。アドリアマイシンの投与により心筋細胞の死、ANP、CARP遺伝子発現の低下、心筋線維の疎小化・変性、心機能の低下が認められた。これらの変化はいずれも1型受容体ノックアウトマウスでは認められず、また1型受容体拮抗薬の投与により抑制された。従って、アドリアマイシン心筋症の発症に、ATⅡ/AT1が関与していることが明らかとなった。
6)水・電解質代謝におけるグアニリンファミリーの基礎的、臨床的研究:心不全, 腎疾患におけるウログアニリンの病態生理学的意義を検討した。各種腎疾患とウログアニリンの関連を解析し、ウログアニリンが腎臓におけるナトリウム代謝と関連し、ネフローゼ症候群では体液量調節に何らかの役割を果たしていると考えられた。血液透析において血漿ウログアニリン濃度は透析間の体重増加量、血圧および循環血漿量の変化と相関し、これらの調節に関与している。また心不全時に心臓からのウログアニリン分泌は亢進し、心不全患者の心機能を評価するマーカーの1つであり、体液量調節に密接に関与することが示唆された。
7)コレステロール代謝関連受容体の発現調節に関する研究:動脈硬化、心筋梗塞などの疾患には、血管平滑筋細胞へのコレステロールの取り込みが深く関与している。コレステロール輸送に重要な役割を担っている、HDL受容体(SR-BI)遺伝子の発現調節機構の解明を目指して、SB-BI遺伝子上流域のクローニングと転写活性化領域を同定した。さらにEMSAによりDNA結合蛋白質の同定を行い、昆虫細胞SL2を用いてSp1ファミリーの役割を検討した。ルシフェラーゼ法により、SR-BI遺伝子上流-140bp付近に存在する3カ所のGCボックスがSR-BI遺伝子発現に重要であることを明らかにした。これらのGCボックスにはSp1とSp3が共に結合し、両者は共にSR-BI遺伝子の転写を著しく促進した。これらの結果、SR-BI遺伝子の発現にはSp1ファミリーが重要であることが明らかとなった。
2)ナトリウム利尿ペプチド(BNPおよびCNP)の臨床診断的意義の検討と治療への応用:ナトリウム利尿ペプチドの成人病及び老化における病態生理的意義と臨床応用への可能性を明らかにするため、BNPノックアウトマウスにおける腹部大動脈縮窄の影響を検討した。BNPノックアウトマウスでは心室肥大とともに心筋線維化の明らかな増悪が認められ、BNPは心室圧負荷に対して迅速に反応し、心筋線維化を抑制することが明らかになった。又、CNPの骨軟骨形成因子としての意義を明らかにするために、成長板軟骨でCNPを発現するトランスジェニックマウスを作製した。内軟骨性骨化の促進を伴う著しい体幹及び四肢の伸長が認められ、CNPが骨軟骨局所で内軟骨性骨化促進因子として作用することが明らかになった。
3)心血管系における2種類のエンドセリン受容体発現のスイッチ機構と動脈硬化:G蛋白質共役受容体キナーゼ2(GRK2)による受容体シグナルのリン酸化非依存性の抑制機序の解明を目指し、GRK2変異体の機能を解析した。ET-1とアンジオテンシン(AT)Ⅱに対する細胞内Ca応答を解析すると、GRK2やキナーゼ不活性のGRK2-K220Wだけでなく、キナーゼ・PHドメイン欠損体GRK2(1-181)、GRK2(54-174)でもCa応答の強い抑制を認めた。一方、全長GRK2、GRK2(1-181)は選択的にGqと結合し、Gi/o, Gsとは結合しなかった。以上より、GRK2のN末端部の新しいRGSドメイン(54-174)がGqに結合して受容体シグナルを抑制するリン酸化非依存の機序が示唆された。
4)動脈硬化の発症、進行における内因性血管作動物質の病態生理的役割の検討:アドレノメデュリン(AM)は血管緊張の調節ばかりでなく細胞増殖や分化の調節にも関与することから、AMの内皮細胞のアポトーシスに及ぼす影響を検討した。ヒト臍帯静脈の内皮細胞は血清除去培地で培養するとアポトーシスを生ずる。AM投与は用量依存的に核濃縮及び細胞死を減少させた。cAMPアナログや細胞内cAMP増加作用物質には抗アポトーシス作用は見られなかったが、L-NAMEの存在下ではAMのこの作用は抑制された。1～10μMのSNPによる抗アポトーシス作用は可溶性グアニリルシクラーゼの阻害や8-br-cGMPの存在で変化しなかった。AMおよびNOは内皮細胞のアポトーシスをcGMP非依存性に抑制すると考えられる。
5)心臓リモデリングにおけるアンジオテンシン(AT)Ⅱの役割:アドリアマイシンは心毒性を示し心筋症を誘導するがその機序は不明である。アドリアマイシン心筋症発症におけるATⅡの役割について、ATⅡ1型受容体ノックアウトマウスを用いて解析した。アドリアマイシンの投与により心筋細胞の死、ANP、CARP遺伝子発現の低下、心筋線維の疎小化・変性、心機能の低下が認められた。これらの変化はいずれも1型受容体ノックアウトマウスでは認められず、また1型受容体拮抗薬の投与により抑制された。従って、アドリアマイシン心筋症の発症に、ATⅡ/AT1が関与していることが明らかとなった。
6)水・電解質代謝におけるグアニリンファミリーの基礎的、臨床的研究:心不全, 腎疾患におけるウログアニリンの病態生理学的意義を検討した。各種腎疾患とウログアニリンの関連を解析し、ウログアニリンが腎臓におけるナトリウム代謝と関連し、ネフローゼ症候群では体液量調節に何らかの役割を果たしていると考えられた。血液透析において血漿ウログアニリン濃度は透析間の体重増加量、血圧および循環血漿量の変化と相関し、これらの調節に関与している。また心不全時に心臓からのウログアニリン分泌は亢進し、心不全患者の心機能を評価するマーカーの1つであり、体液量調節に密接に関与することが示唆された。
7)コレステロール代謝関連受容体の発現調節に関する研究:動脈硬化、心筋梗塞などの疾患には、血管平滑筋細胞へのコレステロールの取り込みが深く関与している。コレステロール輸送に重要な役割を担っている、HDL受容体(SR-BI)遺伝子の発現調節機構の解明を目指して、SB-BI遺伝子上流域のクローニングと転写活性化領域を同定した。さらにEMSAによりDNA結合蛋白質の同定を行い、昆虫細胞SL2を用いてSp1ファミリーの役割を検討した。ルシフェラーゼ法により、SR-BI遺伝子上流-140bp付近に存在する3カ所のGCボックスがSR-BI遺伝子発現に重要であることを明らかにした。これらのGCボックスにはSp1とSp3が共に結合し、両者は共にSR-BI遺伝子の転写を著しく促進した。これらの結果、SR-BI遺伝子の発現にはSp1ファミリーが重要であることが明らかとなった。
結論
心血管作動性ペプチドとその受容体による心血管系の調節,保護,再構築などの機能制御機序の解析を行った。また、CNPトランスジェニックマウスの作製により、CNPが骨軟骨局所で内軟骨性骨化促進因子として作用すること、ウログアニリンの心不全患者の心機能マーカーとしての可能性、およびHDL受容体としてのSR-BIの遺伝子発現にはSp1ファミリーが重要であることが明らかになった。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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