文献情報
文献番号
199900134A
報告書区分
総括
研究課題名
がんに伴う遺伝子変化を標的とした治療法の開発(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
藤 也寸志(国立病院九州がんセンター)
研究分担者(所属機関)
- 斎藤貴生(佐賀県立病院好生館)
- 中別府雄作(九州大学生体防御医学研究所)
- 河野彬(国立病院九州がんセンター)
- 真柴温一(国立病院九州がんセンター)
- 井口東郎(国立病院九州がんセンター)
- 和田守正(九州大学医学部)
- 森正樹(九州大学生体防御医学研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 がん克服戦略研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
13,500,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
がんは遺伝子の病気であり、その遺伝子異常に基づいた治療戦略や治療法の適用が、治療成績、患者のQOLの向上や経済的・効率的治療の開発につながることは明らかである。本研究の目的は、がんの発生・増殖・進展などその生物学的本質に関わる遺伝子異常や抗がん剤・放射線耐性遺伝子、がん特異的抗原などに着目し、それらを標的とした多角的な新しい治療戦略や治療法の開発を行うことにある。(1) 新たながん免疫療法としてMAGE抗原を標的とした消化器癌に対するがんワクチン療法の確立を目指す。(2) 種々のDNA修復遺伝子の発現異常が抗がん剤や放射線に対する感受性をどのように変化させるのかを正確に評価できるモデル動物を樹立する。ヒト癌におけるDNA修復遺伝子の発現異常を調べる。また臨床検体でのミスマッチ修復遺伝子の異常を解析し多重がんの治療戦略への応用の可能性を検討する。(3) 抗がん剤や放射線への新しい耐性因子の同定とその解析を通じて、その発現の抑制に基づくがん治療法・発現の検索による適切な抗がん剤の選択への道を開く。(4)チロシンリン酸化を標的とした漢方薬由来物質によるがん増殖の抑制に関する研究、また骨転移成立に関与するサイトカインを明らかにし、それを標的とした治療法の開発を目指す。さらに新たながん治療の標的分子の同定を試みる。
研究方法
(1) HLA-A2または-A24の進行再発消化器がん症例に対して腫瘍拒絶抗原MAGE-3の発現陽性例に対し、今年度は3例にがんワクチン療法を施行した。(2) アルキル化剤と活性酸素によるDNA損傷の修復に関わる種々の修復酵素について機能欠損型の変異を持つマウスを作製し、各マウスの抗がん剤や放射線に対する感受性の変化を個体レベルで解析した。ヒトMGMTに特異的な抗体を作製し、肝癌における発現を検討した。がんの手術摘出標本に対しmicrosatellite instability (MSI) を検索し、多発・重複がんにおけるミスマッチ修復異常の関与についての検討を継続した。(3) MDR1 遺伝子以外の抗がん剤排出ポンプの実体を同定し、それぞれの排出ポンプが輸送する抗がん剤のスペクトラムを明らかにし、また臨床例における耐性獲得マーカーとしての有効性を検討した。さらにMDR1 を含めた排出ポンプ遺伝子の臨床例における発現亢進機構を明らかにした。大腸がんのMn-SODのAntisense RNA発現株を樹立し、抗がん剤・放射線感受性の変化を調べ、アポトーシスとの関連を検討した。(4) EGFレセプターを高発現ヒト癌細胞株を用いて、チロシンキナーゼ阻害活性を有する大黄由来のエモジンとグリチルリチンとの併用による増殖抑制効果をin vivoで検討した。独自に単離、報告した新規がん転移関連遺伝子 MTA1に関して構造・機能の解析を行った。
結果と考察
(1) 本年度は新たに3例(食道癌2例、大腸癌1例)の進行消化器癌患者に対し治療を施行した。3例ともに予定の治療を完遂できた。副作用は認められなかった。画像による効果判定では2例が MR、1例がPD であった。大腸癌症例は、治療前には胸壁への転移腫瘍による無気肺があり呼吸苦があったが、治療により腫瘍の縮小と無気肺が改善され Performance Statusが3から1へ改善した。Recall 法により治療後のペプチドに対する CTL 誘導能の上昇を1例に認め、2例で遅延型過敏皮内反応を認めた。腫瘍マーカーの低下を2例に認めた。今後、ワクチンの投与法や適応症例の選別などにより有効な治療法となりうる可能性が
示唆されたと考えられる。
(2) 330例に対してMSIの検索を行った。5 loci 中、1 locus 以上で RERを認めた症例は 330 例中 12.4%であった。臓器別では大腸癌10.9%、胃癌20.0%、肺癌9.4%、膵癌25%、肝癌0%であった。一方、2 loci 以上でRERを認めた症例は大腸癌2.7%、胃癌12.0%、肺癌0.7%であった。重複がんの有無別にRERの頻度を見ると、重複・多発がん症例では 43例中 4 例 (9.3%) であったのに対して、単発がん症例では 260例中 33例 (12.0%) と差はなかった。2 loci 以上でも RERを認めた症例に限っても重複・多発がん症例では全く差がなかった。現時点では、本解析は一般に報告されているような多重癌の発生の予知指標になる可能性は少ないと思われた。
MGMTを欠損するマウスは、アルキル化剤に高感受性であるが、ミスマッチ修復遺伝子(MLH1) をヘテロに欠損するだけでもアルキル化剤による細胞死に対して抵抗性を獲得し、さらに発がん頻度が上昇することを明らかにした。MLH1遺伝子欠損がヘテロでもアルキル化剤に対して抵抗性を獲得し発がん頻度が上昇することは、家族性非腺腫症大腸癌患者におけるがんの化学療法や放射線療法の選択に重要な示唆を与えるものである。また、ヒト肝細胞癌組織におけるMGMT発現の異常を新たに作成した抗体を用いて免疫染色法によりスクリーニングした。その結果、MGMT発現(-)肝細胞癌患者は発現(+)患者と比べ有意に予後は悪かった。MGMT発現が見られない患者においては肝炎ウイルスの感染が有意に高かった。MGMT発現(-)のケースに関しては、アルキル化剤の投与が予後不良を改善する可能性を示唆する。
(3) 既に単離しているMRP2/cMOAT遺伝子に加え、新たにMRP3遺伝子の完全長cDNAおよびMRP4、MRP5、MRP6遺伝子の部分cDNAを単離した。加えてMRP遺伝子に近縁の未知遺伝子の部分cDNAを単離した。LLC-PK1細胞からMRP3遺伝子の安定導入細胞株を単離し、感受性試験によりMRP3遺伝子が抗がん剤エトポシドに対する耐性獲得に関与することを明らかにした。大腸がん45検体について、MRPサブファミリー遺伝子群の発現を定量的PCR法により検討した結果、MRP2遺伝子発現がシスプラチン感受性に関与していることが示された。またヒト MDR1遺伝子に関しては、メチル化によるMDR1遺伝子の発現制御は膀胱がんや大腸がんなどの固形腫瘍でも観察されること、この発現制御はプロモーターの特定部位のメチル化によるのではなく、プロモーター領域全体のメチル化の程度に依存することを明らかにした。抗がん剤耐性にともなうMDR1遺伝子周辺のゲノム再編成を解析した結果、DNA再編成により遠隔遺伝子のプロモーターがMDR1遺伝子上流に結合してMDR1遺伝子の発現を活性化する機構を発見した。MDR1遺伝子の選択的なメチル化によって耐性を克服するという新しい治療法開発へつながる可能瀬がある。
大腸がん細胞のアンチセンスMn-SOD RNA発現株は、Doxorubicin 、放射線、温熱に対する感受性に対する感受性が有意に増強していた。効果増強の機序として、ミトコンドリアの膜電位の低下に起因するアポトーシスの増強が明らかとなった。大腸がんにおいてMn-SOD が治療耐性克服のための遺伝子治療の標的となりうる可能性が示唆された。
(4) A431癌細胞のin vivoでの増殖はCDDPとエモジンとグリチルリチンを併用することにより抑制された。漢方薬由来物質によるシグナル伝達系の阻害によるがん治療は、臨床応用が可能と思われる。
MTA1はsrc-homology domain 3-結合モチーフ、Znフィンガーモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、SANTドメイン、核移行シグナル、酸性アミノ酸領域を有しており、転写調節に関わるタンパクであることが推定された。細胞内局在は核であり、免疫沈降法によりMTA1とヒストン脱アセチル化酵素が、同一複合体に含まれていることを明らかにした。MTA1 の発現抑制により細胞増殖の有意な抑制が見られることは、MTA1 が癌の遺伝子治療の標的となりうる可能性を示唆している。
示唆されたと考えられる。
(2) 330例に対してMSIの検索を行った。5 loci 中、1 locus 以上で RERを認めた症例は 330 例中 12.4%であった。臓器別では大腸癌10.9%、胃癌20.0%、肺癌9.4%、膵癌25%、肝癌0%であった。一方、2 loci 以上でRERを認めた症例は大腸癌2.7%、胃癌12.0%、肺癌0.7%であった。重複がんの有無別にRERの頻度を見ると、重複・多発がん症例では 43例中 4 例 (9.3%) であったのに対して、単発がん症例では 260例中 33例 (12.0%) と差はなかった。2 loci 以上でも RERを認めた症例に限っても重複・多発がん症例では全く差がなかった。現時点では、本解析は一般に報告されているような多重癌の発生の予知指標になる可能性は少ないと思われた。
MGMTを欠損するマウスは、アルキル化剤に高感受性であるが、ミスマッチ修復遺伝子(MLH1) をヘテロに欠損するだけでもアルキル化剤による細胞死に対して抵抗性を獲得し、さらに発がん頻度が上昇することを明らかにした。MLH1遺伝子欠損がヘテロでもアルキル化剤に対して抵抗性を獲得し発がん頻度が上昇することは、家族性非腺腫症大腸癌患者におけるがんの化学療法や放射線療法の選択に重要な示唆を与えるものである。また、ヒト肝細胞癌組織におけるMGMT発現の異常を新たに作成した抗体を用いて免疫染色法によりスクリーニングした。その結果、MGMT発現(-)肝細胞癌患者は発現(+)患者と比べ有意に予後は悪かった。MGMT発現が見られない患者においては肝炎ウイルスの感染が有意に高かった。MGMT発現(-)のケースに関しては、アルキル化剤の投与が予後不良を改善する可能性を示唆する。
(3) 既に単離しているMRP2/cMOAT遺伝子に加え、新たにMRP3遺伝子の完全長cDNAおよびMRP4、MRP5、MRP6遺伝子の部分cDNAを単離した。加えてMRP遺伝子に近縁の未知遺伝子の部分cDNAを単離した。LLC-PK1細胞からMRP3遺伝子の安定導入細胞株を単離し、感受性試験によりMRP3遺伝子が抗がん剤エトポシドに対する耐性獲得に関与することを明らかにした。大腸がん45検体について、MRPサブファミリー遺伝子群の発現を定量的PCR法により検討した結果、MRP2遺伝子発現がシスプラチン感受性に関与していることが示された。またヒト MDR1遺伝子に関しては、メチル化によるMDR1遺伝子の発現制御は膀胱がんや大腸がんなどの固形腫瘍でも観察されること、この発現制御はプロモーターの特定部位のメチル化によるのではなく、プロモーター領域全体のメチル化の程度に依存することを明らかにした。抗がん剤耐性にともなうMDR1遺伝子周辺のゲノム再編成を解析した結果、DNA再編成により遠隔遺伝子のプロモーターがMDR1遺伝子上流に結合してMDR1遺伝子の発現を活性化する機構を発見した。MDR1遺伝子の選択的なメチル化によって耐性を克服するという新しい治療法開発へつながる可能瀬がある。
大腸がん細胞のアンチセンスMn-SOD RNA発現株は、Doxorubicin 、放射線、温熱に対する感受性に対する感受性が有意に増強していた。効果増強の機序として、ミトコンドリアの膜電位の低下に起因するアポトーシスの増強が明らかとなった。大腸がんにおいてMn-SOD が治療耐性克服のための遺伝子治療の標的となりうる可能性が示唆された。
(4) A431癌細胞のin vivoでの増殖はCDDPとエモジンとグリチルリチンを併用することにより抑制された。漢方薬由来物質によるシグナル伝達系の阻害によるがん治療は、臨床応用が可能と思われる。
MTA1はsrc-homology domain 3-結合モチーフ、Znフィンガーモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、SANTドメイン、核移行シグナル、酸性アミノ酸領域を有しており、転写調節に関わるタンパクであることが推定された。細胞内局在は核であり、免疫沈降法によりMTA1とヒストン脱アセチル化酵素が、同一複合体に含まれていることを明らかにした。MTA1 の発現抑制により細胞増殖の有意な抑制が見られることは、MTA1 が癌の遺伝子治療の標的となりうる可能性を示唆している。
結論
MAGE-3ペプチドを用いたDCワクチン療法は臨床試験が開始され、進行再発消化器癌症例に対する安全ながん特異的免疫療法となる可能性が示唆された。DNA 修復遺伝子の異常に関する研究では、種々の DNA修復遺伝子の欠損マウスの樹立に基づく基礎的解析と特異的抗体の作成の成功に基づく個体レベルでの種々の DNA 修復能の定量法の確立は、抗がん剤や放射線の適応や投与量の決定などに大きな進歩をもたらすものと思われる。Mn-SOD やMDR1、MRPを新しい抗がん剤や放射線への新しい耐性因子として捉え、これらが遺伝子治療や治療感受性の予知などの標的遺伝子となりうる可能性を示し、今後の臨床応用への道が開かれたものと考えられる。またMTA1の機能の本態はヒストン脱アセチル化を介する遺伝子転写の抑制にあると推定され、新しい研究分野として注目され、また、MTA1は癌の浸潤,転移や増殖に重要な役割を果たしている可能性が高く、癌治療の有望な標的遺伝子となりうるものと期待される。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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