がん関連遺伝子と腫瘍免疫を用いたがんの早期診断と予後の研究(総括研究報告書)

文献情報

• 文献番号: 199900128A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: がん関連遺伝子と腫瘍免疫を用いたがんの早期診断と予後の研究(総括研究報告書)
• 課題番号: -
• 研究年度: 平成11(1999)年度
• 研究代表者(所属機関): 金子 安比古(埼玉県立がんセンター)

研究分担者(所属機関)

• 石井勝(埼玉県立がんセンター)
• 林眞一(埼玉県立がんセンター)
• 土屋永壽(埼玉県立がんセンター)
• 末岡榮三郎(埼玉県立がんセンター)

• 研究区分: 厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 がん克服戦略研究事業
• 研究開始年度: 平成9(1997)年度
• 研究終了予定年度: 平成11(1999)年度
• 研究費: 12,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

がんは遺伝子異常により発生し、遺伝子異常が悪性度を決定しているので、その解明は、がんの診断や予後の予知、治療法の改善に役立つ。青少年に好発する骨軟部腫瘍、ホルモン依存性がんである乳癌、近年増加している肺癌、その他の癌を対象として、遺伝子構造、遺伝子発現、蛋白発現の異常を分析し、その異常と臨床像の関係を解明する。骨軟部腫瘍の病理診断は難しく、診断を誤ったり、最終診断に手間取ることが多いため、適切な治療が適切な時期に開始されないことがある。遺伝子診断は特異性が高いので、骨軟部腫瘍の確定診断に役立つ。骨軟部腫瘍のがん抑制遺伝子の変異が、予後因子であることが証明できれば、その分析結果は治療法の選択に役立つ。乳癌や、胃癌、大腸癌に対して、一次医療(かかりつけ医)において役立つ簡便な早期診断法が求められている。私たちの研究により、血中MDM2自己抗体を用いたがんの血清学的診断法が確立できれば、臨床的有用性は高い。ステロイドホルモンはその受容体を介して種々の標的遺伝子の発現を調節している。受容体の発現量は細胞のホルモン感受性を規定する。また、癌の進展・悪性化に伴いホルモン依存性は消失し、ホルモン療法が無効になることが知られている。受容体の発現量の調節機構やホルモン依存性消失の機構は不明であるが、これを解明できれば、新たなホルモン依存性癌の診断と治療に役立つと考えられる。手術可能な早期の肺癌患者でも約40%はその後、進展、転移により死亡する。摘出肺癌のp53異常が予後因子として有用であると分かれば、術後の治療方針の決定に役立つ。hnRNP B1蛋白は肺癌の早期から出現している。形態異常を示さない病変や前癌病変が、hnRNP B1坑体で陽性に染色されれば、肺癌の病理組織診断上、有用な情報となりえる。また肺癌検診で得られた喀痰細胞診サンプルをhnRNP B1坑体で染色し、肺がん細胞の検出を試みる。その有用性が証明されれば、喀痰による肺癌検診の精度の向上に役立つ。

研究方法

骨軟部腫瘍の研究は骨肉腫30例とEwing肉腫24例を対象として行われた。Ewing肉腫24例中、全例がサザン法またはRT-PCR法によりEWS融合遺伝子を有していると証明された。骨肉腫とEwing肉腫において、癌抑制遺伝子p53, P15, P16, P14と癌遺伝子MDM2の異常を、サザン法、PCR-SSCP法、塩基配列決定法にて分析した。P15, P16については、メチル化部位認識制限酵素とサザン法によるメチル化についても分析した。遺伝子異常の有無により患者を分類し、各群の無病生存曲線をKaplan-Meier法でもとめ、有意差をlog-rank法により検定した。血中MDM2蛋白自己抗体の測定方法として、まずMDM2蛋白のN末端側の20アミノ酸残基から成る合成ペプタイドを抗原として用い、特異的なポリクローナル家兎抗体を作製した。マイクロプレート固相化MDM2蛋白合成ペプタイド抗原に対して、血中のMDM2蛋白自己抗体とMDM2蛋白合成ペプタイド特異家兎抗体とを競合免疫反応させる酵素免疫測定法(EIA)を開発した。対象検体は男性69例および女性65例の計134例の血清を用いた。内訳は健常男女が各20例、各種癌患者が94例であった。乳癌細胞株を用いて、エストロゲンレセプター (ER) 遺伝子の発現調節領域の分子生物学的解析から、発現亢進の原因となっている因子をルシフェラーゼ法やゲルシフト法で探索し、単離同定を試みた。さらに主要な発現抑制の機序と考えられる遺伝子のメチル化についても解析した。切除非小細胞肺癌144例(腺癌109、扁平上皮癌37)を対象としてp53異常を分析し
た。いずれの症例も術後5年以上経過し、完全な予後追跡が行われている。腫瘍組織から抽出したDNAを用いて、p53遺伝子のエクソン 4-8、 及び10をPCR-SSCP法で検索し、塩基配列解析を行った。遺伝子異常の種類はmissense 変異とnull 変異に分類した。免疫染色は腺癌例に対してRSP53抗体を用いて行い、腫瘍細胞の15%以上が染色された場合陽性とした。生存曲線はKaplan-Meier法で求め、予後因子をlog-rank法および多変量解析で検討した。微小肺扁平上皮癌および異形成組織、あるいは口腔扁平上皮癌および口腔白板症について、hnRNP B1蛋白質の発現を免疫組織染色法を用いて解析した。また、喀痰を用いた肺がんのスクリーニングへの応用を考え、抗hnRNP B1抗体による免疫化学法で、喀痰中の肺がん細胞の同定を行なった。

結果と考察

Ewing肉腫と骨肉腫において、癌抑制遺伝子P16, P15, P14, p53と癌遺伝子MDM2の異常を分析した。P16, P15, P14異常は両肉腫の10～20%にみられた。p53異常は骨肉腫の50%にみられたが、Ewing肉腫には4%しかみられなかった。p53異常は骨肉腫の、P16, P14異常はEwing肉腫の予後不良因子であった。Ewing肉腫の発生にはEWS融合遺伝子が、骨肉腫の発生にはp53異常が、決定的な役割を果たしていると考えられた。MDM2蛋白はがん抑制遺伝子産物p53蛋白の分解に係り、癌の発生、進展に重要な役割を演じる。早期がん診断法の開発を目的として血中MDM2自己抗体を検出するEIA法を開発した。本測定法により血中MDM2蛋白自己抗体を測定した結果、男性では大腸癌、胃癌、肺癌、女性では乳癌の腫瘍マーカーとしての有用性が示された。ERの乳癌特異的な転写の亢進がなぜ、どのような分子機序で引き起こされているのか、in vivo, in vitro 両面からの解析を進めてそのメカニズムの一部を明らかにした。また、癌の進展に伴うERの発現消失機構についても検討し、臨床的にも重要なホルモン療法耐性の機構にも取り組んだ。非小細胞肺癌切除144例のp53遺伝子異常を分析し、missense 変異とnull 変異に分類し、それらと免疫染色陽性との一致率及び予後との関係を検討した。p53異常のうち68%はmissense 変異、32% がnull 変異であった。免疫染色との関係は、missense 変異は76% が陽性であったが、null 変異は93% が陰性で、遺伝子異常と免疫染色陽性の一致率は65%と低かった。null 変異は病理病期 I の患者において予後不良因子であると証明できた。RNA結合蛋白質であるhnRNP B1 蛋白質は肺癌細胞に特異的に高発現していることを見いだした。今年度はhnRNP B1 蛋白質の過剰発現が、微小肺扁平上皮癌の58.1%(25/48)及び異形成においても認められることを明らかにした。また、hnRNP B1 蛋白質の過剰発現は口腔扁平上皮癌の早期および前がん病変である口腔白板症においても認められた。

結論

骨軟部腫瘍の癌抑制遺伝子異常が予後不良因子であることを示した。この結果が多数例による追試で確認されるなら、予後因子により骨軟部腫瘍患者を層別化し、リスクに応じた治療を試みて、治療成績が改善するかどうか調べてみたい。血中MDM2蛋白自己抗体を競合免疫反応に基づくEIA法により分析し、早期がん診断への臨床的有用性を検討した。男性では大腸癌、胃癌、肺癌、女性では乳癌の腫瘍マーカーとしての有用性が示唆された。ER遺伝子の癌特異的発現亢進にERBF-1が重要であることを明らかにした。また、ER発現の抑制はこれらの因子の消失や遺伝子そのもののメチル化など複数の機構によることを明らかにした。p53遺伝子異常のうちnull 変異は約1/3と高頻度に存在し、早期肺癌(病理病期 I 期)の予後不良因子である。また、null変異をもつ腫瘍の免疫染色は陰性である。null 変異を有する早期肺癌は化学療法が適応になる。hnRNP B1蛋白の高発現は、肺扁平上皮癌の全例に、臨床病期I期から認められた。またhnRNP B1蛋白の発現亢進は、潜在微小肺扁平上皮癌および異形成病変においても認められたので、早期診断への臨床的有用性が高いと考える。さらに、hnRNP B1蛋白は早期口腔癌および口腔白板症においても過剰発現していたので、これらの病変の診断にも有用である。以上のよう
に、癌で生じているさまざまな遺伝子の構造・発現異常を、DNA,RNA,蛋白、自己抗体により検出することにより、癌の診断や予後の予測が可能になる。今後、研究の成果を臨床に応用したい。

公開日・更新日

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