文献情報
文献番号
199900109A
報告書区分
総括
研究課題名
ウイルス発がんにおける細胞のがん化機構解明に関する研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
加藤 宣之(岡山大学)
研究分担者(所属機関)
- 小原道法(東京都臨床医学総合研究所)
- 徳久剛史(千葉大学)
- 下遠野邦忠(京都大学ウイルス研究所)
- 林紀夫(大阪大学)
- 小池克郎(癌研究会癌研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 がん克服戦略研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
42,500,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
ウイルスの感染が重要な発がんの因子となると考えられているがんの中で、特にわが国において発症者数が急激に増加している肝臓がんに焦点をあて、発がんの分子機構の解明とがん発症を抑制する手段の開発を目的とする。わが国における肝臓がんによる死亡者数は臓器別では第3位であり、そのうちの9割にはC型肝炎ウイルス(HCV)或いはB型肝炎ウイルス(HBV)の感染が認められる。したがって、感染者からのがんの発生を抑えることができれば、肝臓がんの発生は激減するものと考えられる。そのためにはウイルスの感染機構や増殖機構並びに発がん機構を解明し、感染者からのウイルスの排除及びがん発生を予防する手段の開発が必要である。本研究を効率良く遂行するためには、実験室レベルでのウイルスの感染増殖系の開発・確立が必要である。それと同時に肝炎及び肝がんの動物モデルの開発も必要である。一方、ウイルスによる発がん機構の解明には、ウイルス遺伝子及びその産物を指標にして、細胞側の遺伝子変化を追及することができるという利点がある。肝臓がん、特に、HCVの関与するものに関しては微小がんにおいても、既知のがん遺伝子やがん抑制遺伝子の異常がほとんど報告されていないことから、本研究により、細胞がん化に関与する新たな遺伝子が同定される可能性がある。ウイルスと細胞との相互作用を理解することにより、細胞からのウイルスの効率の良い排除法の開発を目指す。現在、唯一有効な抗HCV薬としてインターフェロンが用いられているが、30%の患者に対してしか効果がなく、副作用も強く、より安全で有効な薬剤の開発が必要とされていることから、インターフェロン以外の有効な抗HCV薬を早急に開発必要がある。また、HBVによる肝がん発症もその背景には慢性肝炎があるが、最近、ウイルス抗原に対する免疫応答による細胞傷害ばかりでなく、HBVのX蛋白質による直接的細胞傷害が明らかになってきたことから、その傷害機構を明らかにし、慢性肝炎の治療および肝発がん予防への足がかりを得ることを目的とする。
研究方法
(1) 正常ヒト乳腺組織よりfull length ラクトフェリンcDNAを単離し、大腸菌で幾つかのラクトフェリン断片を発現させた。CHO細胞にて発現分泌させたHCV E2エンベロープ蛋白質をプローブとしてラクトフェリンのどの領域が直接的相互作用を示すかをFar-Western blot法により検討した。
(2)インフォームドコンセントの得られたC型慢性肝炎患者11例に対してラクトフェリン(1.8～3.6 g / day)を8週間経口投与し、2週間ごとに血中HCV量と肝機能の指標としてALT値をそれぞれ測定した。
(3)HCV蛋白質発現ベクターをPH5CH8細胞に導入後、2日経過した時点で、MACselectシステムを用いてHCVコアやNS5A蛋白質を発現している細胞を濃縮した。その結果、発現細胞の精製度は80%以上のものが得られ、それらからRNAを調製し、以後の解析に使用した。コントロール用のRNA試料はHCV蛋白質をコードしているcDNAを含まない空プラスミドベクターを導入した細胞から得た。これらのRNA試料をプローブとして市販のHuman cancerおよびHuman cDNA発現アレイ(1176種類の既知遺伝子)を用いてHCV蛋白質の発現により発現量に影響を受ける遺伝子を探索した。
(4)HCVゲノム全長のcDNAあるいはRNAをヒト肝細胞にトランスフエクションし、HCV蛋白質を発現させた。HCVゲノムの複製効率についてはRTD-PCR法により、粒子形成の有無については培養上清の密度勾配遠心および免疫電子顕微鏡法により検討を行った。さらにこの培養上清を用いて再感染を行った。
(5)ヒト肝細胞によるHCV感染増殖系を用いてHCVの複製機構とシクロスポリンAの作用機序について解析した。シクロスポリンAを感染培養系に添加し、抗ウイルス効果を検討した。
(6)HCV由来の非構造蛋白質の一つであるNS5Aをコードする遺伝子をB型肝炎ウイルスPx遺伝子のプロモーターの支配下に組み換えた。この組み換え遺伝子をC57BL/6マウス由来の受精卵に導入してトランスジェニックマウスを作成した。得られるトランスジェニックマウスにおける肝臓の変化を病理学的に解析した。
(7)HCVコア蛋白質の種々の変異体を作製し、その蛋白質の細胞内局在とNFkBの活性化との関連を調べる。細胞内の局在を変化させるために、コア蛋白質のカルボキシル端部分を欠失させたものに、核局在を変化させる配列などを融合させ、それらを細胞に一過性に発現させてNFkBの活性化を解析する。
(8)Epstein-Barrウイルス(EBV)を感染させたヒトMT-2細胞(HCV高感受性の不死化T細胞)にHCVを感染させてHCVの複製増殖レベルを、EBVの未感染MT-2細胞と比較した。また、EBVのどの遺伝子産物がHCVの複製に影響を与えるかを検討した。
(9)BALB/cマウス由来肝癌細胞株BNL1MEA.7R.1(BNL)にマウスB7-1遺伝子を導入し、B7-1強発現BNL細胞(BNL-mB7-1)を作成した。同系BALB/cマウスにBNL-mB7-1あるいはBNL細胞を皮下接種し、その腫瘍形成を検討した。親株BNL細胞をマウスに皮下接種後、 MMC処理したBNL-mB7-1細胞を癌ワクチンとして用い、その際にIL-12を併用し、その抗腫瘍効果を検討した。
(10)ヒト肝がん培養細胞を用い、HBVのX遺伝子の発現による細胞死の機構解析を行った。X蛋白質がミトコンドリアに結合することを昨年までに明らかにしたので、今年度はX蛋白質の発現によるミトコンドリアノ変化を経時的に免疫蛍光二重染色法を用い追跡した。また、ミトコンドリアとX蛋白質との相互作用とX蛋白質の機能との関係について生化学的 に検討した。
(2)インフォームドコンセントの得られたC型慢性肝炎患者11例に対してラクトフェリン(1.8～3.6 g / day)を8週間経口投与し、2週間ごとに血中HCV量と肝機能の指標としてALT値をそれぞれ測定した。
(3)HCV蛋白質発現ベクターをPH5CH8細胞に導入後、2日経過した時点で、MACselectシステムを用いてHCVコアやNS5A蛋白質を発現している細胞を濃縮した。その結果、発現細胞の精製度は80%以上のものが得られ、それらからRNAを調製し、以後の解析に使用した。コントロール用のRNA試料はHCV蛋白質をコードしているcDNAを含まない空プラスミドベクターを導入した細胞から得た。これらのRNA試料をプローブとして市販のHuman cancerおよびHuman cDNA発現アレイ(1176種類の既知遺伝子)を用いてHCV蛋白質の発現により発現量に影響を受ける遺伝子を探索した。
(4)HCVゲノム全長のcDNAあるいはRNAをヒト肝細胞にトランスフエクションし、HCV蛋白質を発現させた。HCVゲノムの複製効率についてはRTD-PCR法により、粒子形成の有無については培養上清の密度勾配遠心および免疫電子顕微鏡法により検討を行った。さらにこの培養上清を用いて再感染を行った。
(5)ヒト肝細胞によるHCV感染増殖系を用いてHCVの複製機構とシクロスポリンAの作用機序について解析した。シクロスポリンAを感染培養系に添加し、抗ウイルス効果を検討した。
(6)HCV由来の非構造蛋白質の一つであるNS5Aをコードする遺伝子をB型肝炎ウイルスPx遺伝子のプロモーターの支配下に組み換えた。この組み換え遺伝子をC57BL/6マウス由来の受精卵に導入してトランスジェニックマウスを作成した。得られるトランスジェニックマウスにおける肝臓の変化を病理学的に解析した。
(7)HCVコア蛋白質の種々の変異体を作製し、その蛋白質の細胞内局在とNFkBの活性化との関連を調べる。細胞内の局在を変化させるために、コア蛋白質のカルボキシル端部分を欠失させたものに、核局在を変化させる配列などを融合させ、それらを細胞に一過性に発現させてNFkBの活性化を解析する。
(8)Epstein-Barrウイルス(EBV)を感染させたヒトMT-2細胞(HCV高感受性の不死化T細胞)にHCVを感染させてHCVの複製増殖レベルを、EBVの未感染MT-2細胞と比較した。また、EBVのどの遺伝子産物がHCVの複製に影響を与えるかを検討した。
(9)BALB/cマウス由来肝癌細胞株BNL1MEA.7R.1(BNL)にマウスB7-1遺伝子を導入し、B7-1強発現BNL細胞(BNL-mB7-1)を作成した。同系BALB/cマウスにBNL-mB7-1あるいはBNL細胞を皮下接種し、その腫瘍形成を検討した。親株BNL細胞をマウスに皮下接種後、 MMC処理したBNL-mB7-1細胞を癌ワクチンとして用い、その際にIL-12を併用し、その抗腫瘍効果を検討した。
(10)ヒト肝がん培養細胞を用い、HBVのX遺伝子の発現による細胞死の機構解析を行った。X蛋白質がミトコンドリアに結合することを昨年までに明らかにしたので、今年度はX蛋白質の発現によるミトコンドリアノ変化を経時的に免疫蛍光二重染色法を用い追跡した。また、ミトコンドリアとX蛋白質との相互作用とX蛋白質の機能との関係について生化学的 に検討した。
結果と考察
(1)ラクトフェリンは抗菌活性があるので、ラクトフェリン全体を大腸菌で発現させることは困難であった。そこで、ラクトフェリンを立体構造を考慮して、6ケ所の領域に分け、可溶化率の向上が期待されるチオレドキシンとの融合蛋白質として大腸菌で発現させ、His tagを利用して、すべてを精製することができた。これらの領域のうち、カルボキシル末端部の領域がHCV E2蛋白質と直接結合する活性があることを明らかにした。この結果から、昨年度の実験から示唆されたラクトフェリンとHCVとの直接的相互作用が証明されたものと考えられる。
(2)臨床治験を受けた11例のうち、治療開始前のウイルス量が100 kcopy/ml以下の4症例においてはそのうち3例ではラクトフェリン投与中にALT値の改善とHCV RNA値の低下が認められた。1例においてはラクトフェリン投与により血中HCV RNAが検出限界以下になり、著効であった。ラクトフェリン投与による副作用はまったく観察されなかった。ただ、100 kcopy / ml以上の高ウイルス量の7症例では無効であったことから、今後、これらの患者に対しては高用量のラクトフェリン投与が有効ではないかと考えられた。
(3)HCV感染細胞から得られたHCVコアおよびNS5A蛋白質をコードするプラスミド発現ベクターをHCV感受性株であるヒト肝PH5CH8細胞に導入してコアおよびNS5A蛋白質を一過性に過剰発現させ、発現変動の見られる遺伝子の探索を市販のcDNA発現アレイを用いて行った。その結果、コア蛋白質を発現している細胞において、VEGF前駆体のmRNA量の低下が観察された。一方、NS5A蛋白質発現細胞においては、肝がんにおいて過剰発現が報告されているprothymosin alfaの発現が高進していることが分かった。これらの遺伝子の発現量の変化がどのような生物学的意義を有しているかについては今後の検討課題である。
(4)培養上清を蔗糖密度勾配遠心にかけ、分画のコア蛋白質量およびRNA量を測定したところ、1.10と1.25の密度にピークが観察され、免疫電子顕微鏡による検討から50-60nmの抗エンベロープ抗体と特異的に反応するウイルス様粒子が認められた。培養上清中には108-9copy/mlと多量のウイルス粒子が産生され、これを用いて感染実験を行ったところ効率よく感染、複製することが分かった。このウイルス粒子は再感染能を有しており、細胞内で複製が起こる事も示された。これらの事実から、全長HCVcDNAをヒト培養肝細胞で発現させることにより、感染性ウイルス粒子を培養上清に多量に産生させることに成功したものと考えられた。
(5)シクロスポリンAをヒト肝細胞を用いたHCVの感染増殖系に添加し、抗ウイルス効果を検討したところ100ng-1000ng/mlで50-90%の複製抑制効果を示した。感染性cDNAクローンを導入発現している細胞にシクロスポリンAを添加することによりHCVコア蛋白質の燐酸化されたものの量が増加することを見い出した。コア蛋白質の燐酸化の増加とウイルスの複製阻害効果は一致した傾向を示した。
(6)HCV NS5A蛋白質の肝細胞における機能を解析する目的で、NS5A遺伝子を有するトランスジェニックマウスを5系統作成した。その内の2系統において、Northern blot法により肝細胞でのNS5A遺伝子の発現を確認した。従って、今後、これらのトランスジェニックマウスを経過観察することにより、NS5A蛋白質の肝細胞に及ぼす影響を調べることができるものと考えられる。
(7)コア蛋白質のカルボキシル端を欠失させると、核内に移行し、NFkBの活性化を消失した。カルボキシル端を欠失したコア蛋白質に細胞質に移行させる配列を持つペプチドを融合させたものを構築して検討した結果、この蛋白質によりNFkBの活性化が観察され、コア蛋白質が小胞体に局在する時にNFkBの活性化が最大になることを示した。これらの結果から、HCV感染細胞におけるアポトーシスの抑制効果がコア蛋白質によるNFkBの活性化を介して行われる可能性が示された。
(8)EBV未感染MT-2細胞においては、HCV感染後、5日目には細胞内HCVゲノムが検出されなくなるが、EBV感染ヒトMT-2細胞においてはHCV感染後、少なくとも、30日目まで細胞内にHCVゲノムが検出されることを見い出した。EBVの種々の遺伝子のうちEBNA1がこのHCVの複製高進を引き起こしていることを明らかにした。さらに、EBNA1のHCV複製高進能と転写活性化能は相関していることを示した。これらの結果から、EBVがHCVの複製においてヘルパーウイルスとして機能している可能性が考えられた。
(9)BNL-mB7-1細胞をBALB/cマウスに皮下接種し、腫瘍形成を検討した結果、親株BNL細胞の腫瘍形成に比し、BNL-mB7-1細胞の腫瘍形成は有意に抑制された。BNL-mB7-1細胞を癌ワクチンとして用いた検討では、BNL-mB7-1細胞及びIL-12によるワクチンをうけたマウスでは、40%のマウスにおいて親株BNL細胞の腫瘍拒絶を認め、残りのマウスでの腫瘍形成は、BNL-mB7-1細胞によるワクチンのみ施行した群、IL-12単独投群及びPBS投与群に比較して有意に抑制された。BNL-mB7-1細胞及びIL-12によって免疫されたマウスより採取された脾リンパ球は、親株BNL細胞に対して強いCTL活性を示した。これらの結果から、B7-1遺伝子導入肝癌細胞による癌ワクチン及びIL-12の併用によるsystemicかつprotectiveな腫瘍免疫の誘導が可能であることが示された。
(10)X蛋白質のミトコンドリアへの結合が増加すると、ミトコンドリアが凝集し、ミ トコンドリアに著しい傷害(膜電位の低下など)が生じ、その結果、細胞膜のブレビ ング、DNA 鎖切断を伴う細胞死が起こることを明らかにした。また、ミトコンドリア に生じた変化は、bcl-xL の機能と一部関係するが、p53蛋白質の機能とは関係ないこ とを明らかにした。X蛋白質の発現による細胞死とX蛋白質の転写活性化は、X蛋白質中の独立したドメインによることを明らかにした。これらの知見から、X蛋白質が、生体の免疫系と関係なく、直接にミトコンドリア傷害による細胞死を引き起こし、慢性肝炎の発症原因になっていることが示唆された。
(2)臨床治験を受けた11例のうち、治療開始前のウイルス量が100 kcopy/ml以下の4症例においてはそのうち3例ではラクトフェリン投与中にALT値の改善とHCV RNA値の低下が認められた。1例においてはラクトフェリン投与により血中HCV RNAが検出限界以下になり、著効であった。ラクトフェリン投与による副作用はまったく観察されなかった。ただ、100 kcopy / ml以上の高ウイルス量の7症例では無効であったことから、今後、これらの患者に対しては高用量のラクトフェリン投与が有効ではないかと考えられた。
(3)HCV感染細胞から得られたHCVコアおよびNS5A蛋白質をコードするプラスミド発現ベクターをHCV感受性株であるヒト肝PH5CH8細胞に導入してコアおよびNS5A蛋白質を一過性に過剰発現させ、発現変動の見られる遺伝子の探索を市販のcDNA発現アレイを用いて行った。その結果、コア蛋白質を発現している細胞において、VEGF前駆体のmRNA量の低下が観察された。一方、NS5A蛋白質発現細胞においては、肝がんにおいて過剰発現が報告されているprothymosin alfaの発現が高進していることが分かった。これらの遺伝子の発現量の変化がどのような生物学的意義を有しているかについては今後の検討課題である。
(4)培養上清を蔗糖密度勾配遠心にかけ、分画のコア蛋白質量およびRNA量を測定したところ、1.10と1.25の密度にピークが観察され、免疫電子顕微鏡による検討から50-60nmの抗エンベロープ抗体と特異的に反応するウイルス様粒子が認められた。培養上清中には108-9copy/mlと多量のウイルス粒子が産生され、これを用いて感染実験を行ったところ効率よく感染、複製することが分かった。このウイルス粒子は再感染能を有しており、細胞内で複製が起こる事も示された。これらの事実から、全長HCVcDNAをヒト培養肝細胞で発現させることにより、感染性ウイルス粒子を培養上清に多量に産生させることに成功したものと考えられた。
(5)シクロスポリンAをヒト肝細胞を用いたHCVの感染増殖系に添加し、抗ウイルス効果を検討したところ100ng-1000ng/mlで50-90%の複製抑制効果を示した。感染性cDNAクローンを導入発現している細胞にシクロスポリンAを添加することによりHCVコア蛋白質の燐酸化されたものの量が増加することを見い出した。コア蛋白質の燐酸化の増加とウイルスの複製阻害効果は一致した傾向を示した。
(6)HCV NS5A蛋白質の肝細胞における機能を解析する目的で、NS5A遺伝子を有するトランスジェニックマウスを5系統作成した。その内の2系統において、Northern blot法により肝細胞でのNS5A遺伝子の発現を確認した。従って、今後、これらのトランスジェニックマウスを経過観察することにより、NS5A蛋白質の肝細胞に及ぼす影響を調べることができるものと考えられる。
(7)コア蛋白質のカルボキシル端を欠失させると、核内に移行し、NFkBの活性化を消失した。カルボキシル端を欠失したコア蛋白質に細胞質に移行させる配列を持つペプチドを融合させたものを構築して検討した結果、この蛋白質によりNFkBの活性化が観察され、コア蛋白質が小胞体に局在する時にNFkBの活性化が最大になることを示した。これらの結果から、HCV感染細胞におけるアポトーシスの抑制効果がコア蛋白質によるNFkBの活性化を介して行われる可能性が示された。
(8)EBV未感染MT-2細胞においては、HCV感染後、5日目には細胞内HCVゲノムが検出されなくなるが、EBV感染ヒトMT-2細胞においてはHCV感染後、少なくとも、30日目まで細胞内にHCVゲノムが検出されることを見い出した。EBVの種々の遺伝子のうちEBNA1がこのHCVの複製高進を引き起こしていることを明らかにした。さらに、EBNA1のHCV複製高進能と転写活性化能は相関していることを示した。これらの結果から、EBVがHCVの複製においてヘルパーウイルスとして機能している可能性が考えられた。
(9)BNL-mB7-1細胞をBALB/cマウスに皮下接種し、腫瘍形成を検討した結果、親株BNL細胞の腫瘍形成に比し、BNL-mB7-1細胞の腫瘍形成は有意に抑制された。BNL-mB7-1細胞を癌ワクチンとして用いた検討では、BNL-mB7-1細胞及びIL-12によるワクチンをうけたマウスでは、40%のマウスにおいて親株BNL細胞の腫瘍拒絶を認め、残りのマウスでの腫瘍形成は、BNL-mB7-1細胞によるワクチンのみ施行した群、IL-12単独投群及びPBS投与群に比較して有意に抑制された。BNL-mB7-1細胞及びIL-12によって免疫されたマウスより採取された脾リンパ球は、親株BNL細胞に対して強いCTL活性を示した。これらの結果から、B7-1遺伝子導入肝癌細胞による癌ワクチン及びIL-12の併用によるsystemicかつprotectiveな腫瘍免疫の誘導が可能であることが示された。
(10)X蛋白質のミトコンドリアへの結合が増加すると、ミトコンドリアが凝集し、ミ トコンドリアに著しい傷害(膜電位の低下など)が生じ、その結果、細胞膜のブレビ ング、DNA 鎖切断を伴う細胞死が起こることを明らかにした。また、ミトコンドリア に生じた変化は、bcl-xL の機能と一部関係するが、p53蛋白質の機能とは関係ないこ とを明らかにした。X蛋白質の発現による細胞死とX蛋白質の転写活性化は、X蛋白質中の独立したドメインによることを明らかにした。これらの知見から、X蛋白質が、生体の免疫系と関係なく、直接にミトコンドリア傷害による細胞死を引き起こし、慢性肝炎の発症原因になっていることが示唆された。
結論
抗HCV剤であるリコンビナントラクトフェリンを作成し、HCVエンベロープ蛋白質と相互作用する領域を明らかにした。
ラクトフェリンの単独経口投与が慢性C型肝炎患者の一部に有効であることを見い出した。
ヒト培養肝細胞でのHCV蛋白質の発現により発現変動の起こる幾つかの遺伝子を同定した。
全長HCVcDNAをヒト培養肝細胞で発現させ、感染性ウイルス粒子を多量に産生させることに成功した。
シクロスポリンAをヒト肝細胞に添加するとHCVコア蛋白質のリン酸化が高進することを見い出した。
HCVのNS5A蛋白質が肝細胞で発現しているトランスジェニック(Tg)マウスを作製した。
HCVコア蛋白質によるアポトーシス抑制作用の分子機構を明らかにした。
EBVの遺伝子産物がHCVの増殖性を高進させることを見い出した。
マウスを用いたがんワクチン投与実験において、IL-12を併用すると、腫瘍特異的CTL活性が増強され、抗腫瘍効果が増強されることを明らかにした。
HBVのX蛋白質の発現による細胞死と転写活性化は、X蛋白質の独立したドメインによることを明らかにし、X蛋白質による細胞死の機構について検討した。
ラクトフェリンの単独経口投与が慢性C型肝炎患者の一部に有効であることを見い出した。
ヒト培養肝細胞でのHCV蛋白質の発現により発現変動の起こる幾つかの遺伝子を同定した。
全長HCVcDNAをヒト培養肝細胞で発現させ、感染性ウイルス粒子を多量に産生させることに成功した。
シクロスポリンAをヒト肝細胞に添加するとHCVコア蛋白質のリン酸化が高進することを見い出した。
HCVのNS5A蛋白質が肝細胞で発現しているトランスジェニック(Tg)マウスを作製した。
HCVコア蛋白質によるアポトーシス抑制作用の分子機構を明らかにした。
EBVの遺伝子産物がHCVの増殖性を高進させることを見い出した。
マウスを用いたがんワクチン投与実験において、IL-12を併用すると、腫瘍特異的CTL活性が増強され、抗腫瘍効果が増強されることを明らかにした。
HBVのX蛋白質の発現による細胞死と転写活性化は、X蛋白質の独立したドメインによることを明らかにし、X蛋白質による細胞死の機構について検討した。
公開日・更新日
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-
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