ナノマテリアル曝露による慢性及び遅発毒性評価手法の開発に関する研究

文献情報

文献番号
201725017A
報告書区分
総括
研究課題名
ナノマテリアル曝露による慢性及び遅発毒性評価手法の開発に関する研究
課題番号
H27-化学-指定-004
研究年度
平成29(2017)年度
研究代表者(所属機関)
広瀬　明彦(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　安全性予測評価部)
研究分担者(所属機関)
  • 高橋　祐次(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　毒性部)
  • 津田　洋幸(名古屋市立大学　津田特任教授研究室)
  • 本間　正充(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　変異遺伝部)
  • 渡辺　渡(九州保健福祉大学大学院　医療薬学研究科)
  • 石丸　直澄(徳島大学大学院　医歯薬学研究部)
  • 小林　憲弘(国立医薬品食品衛生研究所　生活衛生化学部)
  • 最上　知子(国立医薬品食品衛生研究所　生化学部)
  • 菅野　純(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　安全性予測評価部)
  • 北條　幹(東京都健康安全研究センター　薬事環境科学部　生体影響研究科)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
研究開始年度
平成27(2015)年度
研究終了予定年度
平成29(2017)年度
研究費
32,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
本研究では、これまでにカーボンナノチューブを中心に確立してきた慢性影響や免疫影響、発生影響について、試験系の開発に必要なメカニズム研究を進めると共に、成分や形状の異なった検体を用いた研究を行うことで、より一般化したナノマテリアルに対する分散処理技術としてのTaquann法の応用可能性を検証すること、投与検体の前処理等による分散性の違いが有害性反応に及ぼす影響を検討することを目的としている。
研究方法
H29年度は、慢性影響に関する研究に関して、Taquann法で分散したチタン酸カリウムと繊維長の異なる3種類（平均1、7、15 μm）の二層ナノチューブ（DWCNT）の長期試験を開始すると共に、MWNT-7の前処理の違いによる腹腔内投与慢性実験、MWNT-7によるin vivo肺小核試験の確認試験を行った。免疫影響に関する研究に関しては、チタン酸カリウムと3種類のDWCNTにおけるリンパ球表面マーカーの慢性影響と感染性への影響の比較を行った。発生毒性に関する検討では、気管内投与懸濁液に対するMWCNTの前処理が発生毒性に及ぼす影響を検討した。また、ナノマテリアルの毒性評価手法に関するOECDの動向調査を行った。
結果と考察
慢性影響評価研究において、3種類DWCNT 1、7、15 μmの単回吸入曝露試験を行い、それぞれ0.49、0.51及び0.57 mg/m3の濃度で吸入させ、15 μmの曝露肺ではDWCNTがマクロファージに貪食された繊維を観察できた。チタン酸カリウムのおよびDWCNTの経気管肺内噴霧投与方法の検討では、チタン酸カリウムの52週投与群で胸膜中皮の過形成が観察された。3種のDWCNTについては1匹あたりの21ｘ10^12本/ラットの投与量で慢性試験を開始した。ラットに分散処理の方法を変えた（原末、熱処理、Taquann処理､および両者の組み合わせ）MWNT-7を腹腔投与した検討では、中皮腫の発症時期や重篤度について分散処理の違いによる差異は認められなかった。前年度までに確立したマウスに対するin vivo肺小核試験法（Taquann法処理による直噴全身曝露吸入システム、2時間/日、5日間連続の全身吸入曝露）において、MWCNTは陽性を示すことが確認できた。免疫影響に対する検討では、クロドロン酸リポソームの処理によりマクロファージが機能不全の状態でのMWCNT曝露はマクロファージを起点とした生体防御反応に大きな影響を及ぼす可能性が示された。MRL/lprマウス（自己免疫疾患モデル）へのMWVNTとチタン酸カリウム投与の比較では腹腔内滲出細胞中のマクロファージの細胞数、フェノタイプが大きく異なっていた。DWCNTはMWCNTに比較して腹腔内での曝露反応は低いものと考えられ、DWCNTの処理反応にはスカベンジャー受容体が関与していることが示された。DWCNTs曝露により、RSV感染5日後のマウスでは肺胞壁の腫張やリンパ球の浸潤など肺炎はMWNT-7と同様に増悪化し、最も短いDWCNT-1(1 μm)でその効果が高くMWNT-7と同等かやや強かった。in vitro試験系による検討では、4種のMWCNTによるTNFα産生の促進は、IL-1βのオートクラインによる機構が示された。3種のDWCNT（1, 7.5, 15μm）はNLRP3を介してIL-1β産生を促進したが、TNFα分泌はむしろ低下させた。発生影響に関する検討では、MWCNT投与群で、妊娠15日目の胎児毒性として、胎児重量の減少が認められ､対照群に比べ熱処理群、原末群、Taquann処理群の順に減少量が多かった。反復気管内投与による母動物および胎児への影響でも、分散液の調製方法（分散状態）によって差が見られることが、内臓・骨格検査からも確認された。また，今回検査した項目のうち骨化遅延が最も鋭敏な指標であると考えられた。国際動向調査では、OECD吸入試験法のガイドラインTG412 とTG413がナノマテリアル評価に適応した改定が承認され、さらにナノマテリアル作業会合ではEUが行っているOECDテストガイドラインの改訂や新規の作成作業を促進するプロジェクト活動を受けて7つの新規プロジェクトが提案された。
結論
ナノマテリアルの評価手法としての吸入曝露および気管内投与手法、in vitro評価系において、MWCNT、チタン酸カリウムや二層ナノチューブにTaquann法を用いて、各種エンドポイントの評価が可能であることを示すことができた。今後は、本研究で確立したin vivo試験法等を生かして、より短期の吸入曝露や気管内曝露試験法､in vitro評価系試験法から慢性影響を評価できることを示すデータを積み上げてOECD等に提案できるような実証研究を行っていくことが必要であると考えられえた。

公開日・更新日

公開日
2018-06-12
更新日
-

研究報告書（紙媒体）

文献情報

文献番号
201725017B
報告書区分
総合
研究課題名
ナノマテリアル曝露による慢性及び遅発毒性評価手法の開発に関する研究
課題番号
H27-化学-指定-004
研究年度
平成29(2017)年度
研究代表者(所属機関)
広瀬　明彦(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　安全性予測評価部)
研究分担者(所属機関)
  • 高橋　祐次(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　毒性部)
  • 津田　洋幸(名古屋市立大学　津田特任教授研究室)
  • 本間　正充(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　変異遺伝部)
  • 渡辺　渡(九州保健福祉大学大学院　医療薬学研究科)
  • 石丸　直澄(徳島大学大学院　医歯薬学研究部)
  • 小林　憲弘(国立医薬品食品衛生研究所　生活衛生化学部)
  • 最上　知子(国立医薬品食品衛生研究所　生化学部)
  • 菅野　純(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　安全性予測評価部)
  • 北條　幹(東京都健康安全研究センター　薬事環境科学部生体影響研究科)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
研究開始年度
平成27(2015)年度
研究終了予定年度
平成29(2017)年度
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
本研究は、これまでの研究で多層ナノチューブ（MWCNT）や酸化チタンを中心にして確立してきた慢性影響研究や新規に開発した高度分散手法(Taquann法）を基にして、他のナノマテリアル（チタン酸カリウムや二層ナノチューブ）を用いて発癌性や免疫影響、発生影響に関するメカニズム解析や分散手法であるTaquann法の適用拡大研究を行うことにより、評価系の開発のために基礎的条件を確立することを目的とした。
研究方法
検討材料としては、毒性が明らかとなっている多層ナノチューブ（MWCNT）に加えて、同様の形状で化学組成の異なるチタン酸カリウムと繊維形状の異なる二層ナノチューブを用いた。毒性エンドポイントとしては、これまでの研究でin vivo影響が比較的明確化している発がん性を含む慢性影響、免疫系への影響、次世代への発達に関する影響を評価した。慢性影響検討では、taquann法で分散した吸入および気管内噴霧試験と遺伝毒性評価法を、免疫影響については免疫系異常動物モデルや感染性免疫評価動物モデルを用いた分子生物学的解析を、次世代への影響については、催奇形性に関与する因子の解析を中心に行った。
結果と考察
慢性影響に関する研究として、Taquann法を適用してチタン酸カリウム及び繊維長が異なる3種類の二層ナノチューブを実際にマウスに単回及び反復吸入曝露し経時的な曝露肺のサンプリングにより、肺への影響と肺内負荷量測定を行った。いずれの検体も曝露初期には急性炎症像は認められず、チタン酸カリウムについては、曝露後26週の肺において増殖性の病変は認められたが肉芽腫及び線維化は認められなかった。経気管肺内噴霧法を用いた研究では、現在、チタン酸カリウムの長期観察実験を実施中である。分散性の異なるMWNT-７は腹腔投与によるMWNT-7の中皮腫発症能には影響しないことがわかり、母体への急性的な影響と慢性影響とは作用が異なることが示唆された。遺伝毒性評価に関しては、in situ肺小核試験法を確立し、Taquann法処理したMWNT-7を全身暴露させ、小核試験を実施した結果、高い頻度で小核の誘発を観察した。免疫システムへの影響に関して、MWCNTは腹腔内でのマクロファージの分化異常を介して、全身の免疫制御システムあるいは抗体産生機構に影響を及ぼす可能性が示された。チタン酸カリウム投与後のマクロファージ活性化をMWCNT投与と比較すると、マクロファージの集簇が有意に低いことが判明した。感染性への影響に関して、チタン酸カリウムはMWNT-7よりは炎症の程度は弱いが、同様に感染初期からのRSV肺炎の増悪化を示すことを確認し、二層カーボンナノチューブの肺炎の増悪化効果も認めた。Invitro系では各種多層カーボンナノチューブ、チタン酸カリウム、二層ナノチューブは、いずれもマクロファージにNLRP3インフラマソームを介したIL-1β分泌を促進することを明らかにした。多層ナノチューブではNLRP3を介したTNFα分泌も促進され、分泌されたIL-1βのオートクラインによる機構が判明した。発生影響に関する検討では、気管内投与におけるMWNT-7の分散性の違いは、妊娠マウスの呼吸器に異なった影響を与え、それが胎児の発育不良に関係することを示した。ナノマテリアルの毒性評価手法に関する国際動向調査では、様々なナノマテリアル製品の評価に必要なグルーピング評価やリードアクロス評価手法を適用することが指摘されていたが、同時に、慢性影響のin vivo試験データが現時点で不足していることも浮き彫りとなった。さらに、最近のOECDの動向からは、ナノマテリアルの評価手法の国際的な標準化を目指して、OECDテストガイドラインやガイダンスの改定活動が本格してきており、EUを中心に様々なプロジェクトが立ち上がりつつある。
結論
ナノマテリアルの評価手法としての吸入曝露および気管内投与手法、in vitro評価系において、MWCNT、チタン酸カリウムや二層ナノチューブにTaquann法が有効であることを示すことができた。しかし、現実に規制当局でのリスク評価で使用されるのは吸入曝露手法であるが、全てのナノマテリルで慢性吸入曝露試験を行うのは不可能である。今後は、本研究班で検討している慢性影響評価に関する成果についても、OECDのガイダンス等に取り入れられるように、本研究で確立した吸入試験法や気管内投与手法を生かして、より短期の吸入曝露や気管内曝露試験法､in vitro評価系試験法から慢性影響を評価できることを示すデータを積み上げてOECD等に提案できるような実証研究を行っていくことが必要であると考えられえた。

公開日・更新日

公開日
2018-06-12
更新日
-

研究報告書（紙媒体）

行政効果報告

文献番号
201725017C

成果

専門的・学術的観点からの成果
多層カーボンナノチューブ（MWCNT）による中皮腫誘発性だけではなく、カーボン以外の素材で同様の形状を持つ粒子についても増殖性の変化を示すことを示した。また、投与液の分散性の違いは、急性炎症やそれに伴う生殖毒性の強さに影響を及ぼすが、慢性影響についてはほとんど影響を及ぼさないことが示され、慢性影響の強度は、急性期の炎症性の強さだけでは予測できないことと慢性影響に関連する毒性発現メカニズムを解明する研究が重要であることが示唆された。
臨床的観点からの成果
先行研究ではアスベスト様の形状の多層カーボンナノチューブ（MWCNT）による中皮腫誘発性に関して、繊維長に依存した中皮腫誘発性を明らかにしたが、カーボン以外の素材で同様の形状を持つ粒子についても増殖性の変化を示すことが示され、化学組成にかかわらず線維状粒子の吸入曝露による慢性影響は検討されるべき評価ポイントであることを支持する結果であったと考えられる
ガイドライン等の開発
本研究斑で開発された分散法であるtaquann法はISOの標準試験法化の検討を行っているが、今回CNT以外の物質にも適用できた知見を踏まえ、ナノマテリアルの標準的な試験法のガイダンス等にも適用できる汎用性が示された。また、慢性影響評価法としてはレギュレーションの観点から慢性吸入試験が必須とされているが、本研究班では気管内投与法や短期間の吸入試験法でも慢性影響を予測できることが示されており、本研究の成果を基にしてOECDにおけるナノ粒子評価手法に関するガイダンス作成にむけた提案準備を行っている。
その他行政的観点からの成果
ナノ材料安全問題府省横断有識者ワーキンググループ会議（総合科学技術・イノベーション会議 ナノテクノロジー・材料基盤技術分科会　ナノ材料安全問題実務者連絡会）における議論で、多種多様なカーボンナノチューブすべてについて慢性吸入曝露試験を行うのは実質的に不可能なので、この慢性吸入曝露試験を代替するための手法開発プロジェクトとして、当研究班が開発してきたTaquann法の吸入試験法や気管内投与法の導入を検証するための研究が提言された。（平成29年7月7日）
その他のインパクト
平成25年から27年にかけて日本トキシコロジー学会学術年会では3年連続に「ナノマテリアルの毒性評価の進捗」，「ナノマテリアルの実用化に呼応した有害性評価の進捗」，「カーボンナノチューブの発がん性」というシンポジウムが企画され、研究成果の普及を行ってきている。平成28年の日本薬学会でも「ナノマテリアルの社会受容に向けた安全性評価の最新動向」というシンポジウムでナノマテリアルのリスク評価に必要な課題の提言を行ってきた。

発表件数

原著論文（和文）
0件
原著論文（英文等）
6件
その他論文(和文)
4件
その他論文(英文等)
1件
学会発表(国内学会)
27件
学会発表(国際学会等)
18件
その他成果(特許の出願)
0件
その他成果(特許の取得)
2件
その他成果(施策への反映)
0件
その他成果(普及・啓発活動)
0件

特許

特許の名称
吸入曝露試験装置
詳細情報
分類:
特許番号: 5899592
発明者名: 柴田眞利、菅野純、生田達也、鶴田祐吾、小川幸男、高橋祐次
権利者名: 柴田科学株式会社、国立医薬品食品衛生研究所長
出願年月日: 20120702
取得年月日: 20160318
国内外の別: 国内
特許の名称
高分散性ナノマテリアルの調製方法
詳細情報
分類:
特許番号: 6051427
発明者名: 菅野純、高橋祐次
権利者名: 国立医薬品食品衛生研究所長
出願年月日: 20120717
取得年月日: 20161209
国内外の別: 国内

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限ります。

原著論文1
Fujitani T., Inomata A., OgataA., et al.
Comparison of fetal toxicity of various multi-wall carbon nanotubes in mice
ToxicologyReports , 2 , 1404-1408  (2015)
原著論文2
Hashiguchi, S., Yoshida, H., Akashi, T., et al.
Titanium dioxide nanoparticles exacerbate pneumonia in respiratory syncytial virus (RSV)-infected mice.
Environ. Toxicol. Pharmacol. , 39 , 879-886  (2015)
原著論文3
Suzui M., Futakuchi M., Fukamachi K., et al.
Multiwalled carbon nanotubes intratracheally instilletd into the rat lung induce development of pleural malignant mesothelioma and lung tumors.
Cancer Sci. , 107 , 924-935  (2016)
原著論文4
Shigemoto-Mogami Y., Hoshikawa K., Hirose A., et al.
Phagocytosis-dependent and independent mechanisms underlie the microglial cell damage caused by carbon nanotube agglomerates.
J. ToxicolSci. , 41 , 501-509  (2016)
原著論文5
菅野 純
ナノマテリアル毒性のとらえ方とその難しさ
医学のあゆみ , 259 (3) , 217-222  (2016)
原著論文6
津田洋幸
カーボンナノチューブの肺と胸膜中皮に対する毒性と発がん性の簡易評価法
医学のあゆみ , 259 (3) , 223-227  (2016)
原著論文7
高橋祐次
高分散型小型全身曝露吸入システムによるマウス吸入毒性-ヒトの現実的な曝露シナリオに基づいたナノマテリアルの吸入毒性評価の迅速化と効率化に向けて-
医学のあゆみ , 259 (3) , 234-240  (2016)
原著論文8
石丸直澄
ナノマテリアルと免疫システム
医学のあゆみ , 259 (3) , 241-246  (2016)
原著論文9
Horibata K., Ukai A., Ogata A., et al.
Absence of in vivo mutagenicity of multi-walled carbon nanotubes in single intratracheal instillation study using F344 gpt delta rats.
GenesEnviron. , 39 (4)  (2017)
doi: 10.1186/s41021-016-0065-5
原著論文10
Kobayashi N. Izumi H., Morimoto Y,, et al.
A review of toxicity studies of carbon nanotubes.
Journal of Occupational Health , 59 (5) , 394-407  (2017)
原著論文11
Abdelgied M., El-Gazzar A,, Alexander D., et al.
Potassium octatitanate fibers induce persistent lung and pleural injury and are possibly carcinogenic in male Fischer 344 rats.
CancerSci. , in press  (2018)
doi: 10.1111/cas.13643
原著論文12
Sakamoto Y, Hojo M, Kosugi Y, Watanabe K, Hirose A, Inomata A, Suzuki T, Nakae D.
Comparative study for carcinogenicity of 7 different multi-wall carbon nanotubes with different physicochemical characteristics by a single intraperitoneal injection in male Fischer 344 rats
J Toxicol Sci. , 43 (10) , 587-600  (2018)
doi: 10.2131/jts.43.587

公開日・更新日

公開日
2018-06-13
更新日
2022-07-07

収支報告書

文献番号
201725017Z
報告年月日

収入

(1)補助金交付額
32,000,000円
(2)補助金確定額
31,988,000円
差引額 [(1)-(2)]
12,000円

支出

研究費 (内訳) 直接研究費 物品費 12,632,399円
人件費・謝金 3,466,660円
旅費 3,361,487円
その他 12,528,132円
間接経費 0円
合計 31,988,678円

備考

備考
-

公開日・更新日

公開日
2019-01-11
更新日
-