新規in vitro評価系とマーカーの開発によるナノマテリアルのリスク評価及びリスク低減化に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201725003A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 新規in vitro評価系とマーカーの開発によるナノマテリアルのリスク評価及びリスク低減化に関する研究
• 課題番号: H27-化学-一般-008
• 研究年度: 平成29(2017)年度
• 研究代表者(所属機関): 渡邉 昌俊(三重大学 大学院医学系研究科)

研究分担者(所属機関)

• 林　幸壱朗(九州大学　大学院歯学研究院)
• 戸塚　ゆ加里(国立がん研究センター研究所　発がん・予防研究分野)
• 中江　大(東京農業大学　応用生物学部)
• 宮島　敦子(国立医薬品食品衛生研究所　医療機器部)
• 花方　信孝(国立研究開発法人　物質・材料研究機構)
• 河上　強志(国立医薬品食品衛生研究所　生活衛生化学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成27(2015)年度
• 研究終了予定年度: 平成29(2017)年度
• 研究費: 9,462,000円
• 研究者交替、所属機関変更: 所属期間変更 研究代表者 渡邉昌俊 横浜国立大学大学院工学研究院から三重大学大学院医学系研究科へ変更（平成29年5月1日） 研究分担者 林 幸壱朗 名古屋大学 未来材料・システム研究所から九州大学大学院歯学研究院（平成29年9月1日）

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究は、ナノマテリアルの適切な物性解析、新規in vitro評価系の確立、細胞内応答機構等の解析で従来の評価系との比較検討、新たなマーカーの確立、適切な動物実験等による妥当性の検証を目的とした。

研究方法

平成29年度、(1)ナノマテリアルの作製及びキャラクタリゼーション（林）、(2) 細胞応答に及ぼすナノマテリアルの物性解析(河上)、(3) ナノマテリアルの細胞毒性及び遺伝毒性発現メカニズムの解析（宮島）、(4)共培養系及び3D皮膚モデルを用いたナノマテリアルの遺伝毒性評価系の構築（戸塚）、(5) 3D皮膚モデルを用いたナノマテリアルの経皮毒性評価系構築（中江）、(6)ナノマテリアル曝露による網羅的遺伝子発現解析およびエピジェネティクスマーカーの検索（花方）、(7)切片担体培養系を用いたナノマテリアルのリスク評価系の構築およびナノマテリアルの細胞内動態の解析（渡邉）を物理化学的解析および生物学的解析により行った。

結果と考察

ナノ粒子の合成条件を最適化することによる精密な形状制御およびサイズ制御できる方法、一次粒子径や二次粒子径と細胞毒性との関係から、細胞毒性の要因として、溶出イオンや細胞内取り込みが重要である事を示した。依然解決しなければならない問題もあるが、マウス肺より樹立した細胞株(GDL1細胞) とマクロファージ(RAW264.7)の共培養システムの可能性を示した。3D皮膚モデル(LabCyte EPI-MODEL)を用いたナノマテリアルの経皮毒性評価系構築では、単層培養と比較しながら、病理学的、生化学的など多面的に解析し、皮膚組織のナノ粒子侵入に対するバリア機能などを明らかにし、in vivoに外装できる皮膚一般毒性評価系として使用できる事を示した。カーボンナノチューブ(CNT)のA549、DU145細胞への曝露実験で、網羅的遺伝子発現解析を行い、miRNA発現のクラスタリング解析から、ナノマテリアルによる特徴的なmiRNA変動、すなわちマーカー抽出の可能性を示した。組織特異的な特徴を示すA549細胞の切片担体培養系の使用可能性を示した。また、酸化鉄ナノ粒子の細胞への影響は、粒子側の修飾によるROS産生の有無を起点とするautophagyの関与を明らかにし、有害性発現経路に関わる結果を示した。
研究の実施経過：前年度より引き続き、(1)毒性を有する界面活性剤を用いないナノ粒子の新規作製法及び形態変化をもたらす新規作製法の開発、(2)異なる一次粒子径のナノ粒子よる同程度の二次粒子径の懸濁液の細胞毒性評価および一次粒子径が同じで二次粒子径が異なるナノ粒子の懸濁液による細胞毒性および免疫応答解析、(3)in vivoおよび共培養システムによる遺伝毒性試験、(4)3Dヒト皮膚再構成系におけるナノ粒子の表皮傷害性と表皮侵入性の解析、(5)ナノマテリアル曝露による網羅的遺伝子発現解析およびエピジェネティクスマーカーの検索、(6)切片担体培養系を用いたナノマテリアルのリスク評価系の構築およびナノマテリアルの細胞内動態の解析を行い、総括した。

結論

ナノマテリアルの毒性評価において、ナノ粒子の物理化学的性状および形状・表面修飾は重要な因子である。また、in vitro実験系での二次粒子径あるいはコロナの形成等も重要な因子である。本研究グループにおいて、ナノ粒子の合成条件を最適化することによる精密な形状制御およびサイズ制御できる方法、一次粒子径や二次粒子径と細胞毒性との関係から、溶出イオンや細胞内取り込みの重要性を示した。共培養系や3D皮膚モデルを用いたナノマテリアルの経皮毒性評価系構築では、それぞれの有用性が示された。CNTのA549、DU145細胞への曝露実験で、網羅的遺伝子発現解析を行い、miRNAのクラスタリング解析から、ナノマテリアルによる特徴的なmiRNA変動、すなわちマーカー抽出の可能性を示した。組織特異性を示すA549細胞の切片担体培養系の使用可能性を認めた。また、酸化鉄ナノ粒子の細胞への影響は、粒子側の修飾によるROS産生の有無を起点とするautophagyの関与を明らかにし、有害性発現経路に関わる結果を示した。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-06-04
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201725003B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 新規in vitro評価系とマーカーの開発によるナノマテリアルのリスク評価及びリスク低減化に関する研究
• 課題番号: H27-化学-一般-008
• 研究年度: 平成29(2017)年度
• 研究代表者(所属機関): 渡邉 昌俊(三重大学 大学院医学系研究科)

研究分担者(所属機関)

• 林　幸壱朗(九州大学　大学院歯学研究院)
• 戸塚　ゆ加里(国立がん研究センター研究所　発がん・予防研究分野)
• 中江　大(東京農業大学　応用生物学部)
• 宮島　敦子(国立医薬品食品衛生研究所　医療機器部)
• 花方　信孝(国立研究開発法人　物質・材料研究機構)
• 河上　強志(国立医薬品食品衛生研究所　生活衛生化学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成27(2015)年度
• 研究終了予定年度: 平成29(2017)年度
• 研究者交替、所属機関変更: 所属期間変更 研究代表者 渡邉昌俊 横浜国立大学大学院工学研究院から三重大学大学院医学系研究科へ変更（平成29年5月1日） 研究分担者 林 幸壱朗 名古屋大学 未来材料・システム研究所から九州大学大学院歯学研究院（平成29年9月1日）

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究は、(i)ナノマテリアルのリスク評価のための新規in vitro評価系およびマーカーの開発(ナノマテリアルのDNA損傷性新規評価系およびマーカーの開発, 共培養及び3Dモデルを用いたナノマテリアルの気道毒性新規評価系の開発、共培養及び3Dモデルを用いたナノマテリアルの皮膚毒性新規評価系の開発)、(ii)従来のin vitroリスク評価系との比較検討、in vivo動物実験による当該リスク評価系の検証、 (iii)それらを用いたナノマテリアルのリスク評価、(iv)当該評価結果に基づくリスク低減化方策の考案と検証を目的とした。本研究の生体模倣in vitro評価系およびmicroRNA等の新規マーカーの抽出は他に類を見ず独創的であり、in vitroおよびin vivoの短期毒性試験を補完し、かつ、長期毒性・発がん性試験への橋渡し的な存在となり得ると考えられた。このようなシステムの構築で、動物実験代替法の可能性が生じ、化学産業界に有用な実用的研究のみならず、広く行政および社会へ貢献できると考えられた。
　

研究方法

分担研究者の具体的な研究は、(1) 切片担体培養系を用いたナノマテリアルのリスク評価系の構築、エピジェネティクスマーカーの検索、ナノマテリアルの細胞内動態の解析（渡邉）、(2) ナノマテリアルの作製およびキャラクタリゼーション（林）、(3) 共培養系及び3D皮膚モデルを用いたナノマテリアルの遺伝毒性評価系の構築（戸塚）、(4) ３D皮膚モデルを用いたナノマテリアルの経皮毒性評価系構築（中江）、(5) ナノマテリアルの細胞毒性及び遺伝毒性発現メカニズムの解析（宮島）、(6) ナノマテリアル曝露における網羅的遺伝子発現解析（花方）、(7) 細胞応答に及ぼすナノマテリアルの物性解析（河上）であり、物理化学的解析および生物学的解析手法で行った。

結果と考察

切片担体培養系を用いたナノマテリアルのリスク評価系の構築、ナノマテリアルの細胞内動態と傷害機構の解析では、切片担体と細胞との相互関係が構築され、ナノ粒子曝露実験の結果からも、切片担体培養系が生体内の組織特異的環境を再現している可能性が考えられた。また、細胞傷害機構は、ROSの産生の有無を起点として、細胞の生存シグナルとして重要なNFBの発現への影響によるapoptosisやautophagyの誘導であることが判明した。一方、カルボキシル基修飾で、ROSの産生を抑制するも、細胞生存率の減少を若干抑制するのみで、同様にapoptosisやautophagyを誘導することも判明した。
ナノマテリアルの作製およびキャラクタリゼーションでは、原料や合成条件、またはこれらに依存する反応速度の違いが生成物の形状に影響を与えることを明らかにした。
共培養系及び3D皮膚モデルを用いたナノマテリアルの遺伝毒性評価系の構築では、in vitro共培養系を用いた遺伝毒性評価は生体を模倣した新たな遺伝毒性評価システムとして、ナノマテリアルなどの化学物質の毒性評価に有用であることを示した。
３D皮膚モデルを用いたナノマテリアルの経皮毒性評価系構築では、表皮の重層構造は化学物質あるいはナノ粒子の細胞毒性に対して防御効果を発揮し、（成熟した）角質層はさらに当該防御効果を増強する「バリア機能」を発揮することが示唆された。
ナノマテリアルの細胞毒性及び遺伝毒性発現メカニズムの解析では、細胞毒性や細胞表面マーカーの変化、サイトカインの産生などにナノ粒子の二次粒子径が重要な要素であることを示した。
ナノマテリアル による曝露実験およびmicroRNAマイクロアレイ解析では、ナノ粒子曝露と特異的なmiRNAの抽出やエクソソームとの間液を示した。
細胞応答に及ぼすナノマテリアルの物性解析では、溶出したイオンの影響だけでなく、各ナノマテリアルの細胞への取り込み量の影響の可能性を示した。

結論

ナノマテリアルの物理化学的性状の測定とその細胞への影響、様々な形状のナノマテリアル作製の制御、新規in vitro独紙絵評価系の構築、細胞内の局在及び有害性発現経路(Adverse Outocome Pathway)の解明につながる細胞内シグナリング、さらにそれに連関する可能性があり、またナノマテリアル暴露のバイオマーカーの可能性を示すことができた。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-06-04
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201725003C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 平成27～29年度の本研究において、ナノマテリアルの物理化学的性状の測定とその細胞への影響、様々な形状のナノマテリアル作製の制御、新規in vitro独紙絵評価系の構築、細胞内の局在及び有害性発現経路(Adverse Outocome Pathway)の解明につながる細胞内シグナリング、さらにそれに連関する可能性を認めた。特に、新規in vitro独紙絵評価系の構築に関して、 Cancer Sci, 109(4), 1024-1031, 2018を報告・公開することが出来た。
• 臨床的観点からの成果: ナノマテリアル暴露のバイオマーカーの可能性を示すことができた。特に、ナノマテリアルによる活性酸素種による誘導される場合とナノマテリアル 自体の取り込みによるバイオマーカーの可能性を見出した。動物実験代替法としての（ナノマテリアルの）一般・遺伝毒性評価法の開発が進め，今直ちに行政的に応用できなくても将来の化学物質規制行政に貢献できる成果を上げつつある。
• ガイドライン等の開発: 現在のところ、特記すべき内容はない。
• その他行政的観点からの成果: 本研究は、科学的根拠のある新規in vitroリスク評価系とリスク低減方策を提示することにより、ナノマテリアルのリスク評価/管理に関する厚生労働行政に対して、最善の選択肢の提示に役立つと思われた。また、これらの成果は、安全なナノマテリアルの普及を可能とすることで、市民の健康の維持に貢献すると共に、特に論文及び学会発表などはリスクコミュニケーションに利用することにより、市民の不安解消にも有用と思われた。
• その他のインパクト: １）化粧品のナノテクノロジー安全性情報(2017.10.17 ナノマテリアル WG)での紹介（渡邉らのがん学会での発表内容）; ２）林幸壱朗. “新ナノ粒子でがん狙い撃ち 名大チーム”, 中日新聞. 平成28年12月18日; ３）林幸壱朗. “赤血球状の粒子 肝臓に薬剤運搬”, 日経産業新聞, 平成29年12月8日

発表件数

• 原著論文（和文）: 1件 ; 薬学雑誌
• 原著論文（英文等）: 41件
• その他論文(和文): 7件 ; 東京都健安研セ研究年報、国立衛研報、医学のあゆみなど
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 52件 ; 日本癌学会、日本環境変異原学会、日本毒性学会など
• 学会発表(国際学会等): 22件 ; AACRなど
• その他成果(特許の出願): 2件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 2件

特許

• 特許の名称: フローサイトメトリー用蛍光プローブ及び蛍光標識細胞の選別方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2016-91356 ; 発明者名: 林 幸壱朗, 坂本 渉, 余語利信, 丸岡弘規 ; 権利者名: 名古屋大学, 倉敷紡績株式会社 ; 出願年月日: 20160428 ; 国内外の別: 国内外

• 特許の名称: 蛍光プローブ、蛍光検出方法及び蛍光プローブの使用方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2016-91359 ; 発明者名: 林 幸壱朗, 坂本 渉, 余語利信, 丸岡弘規 ; 権利者名: 名古屋大学, 倉敷紡績株式会社 ; 出願年月日: 20160428 ; 国内外の別: 国内外

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: 岩﨑有由美、岡本大樹、渡邉昌俊 他; 前立腺癌治療へのナノ粒子の応用.; 医学のあゆみ , 252 , 303-308 (2015)
• 原著論文2: 渡邉昌俊, 菅野 純; 特集ナノトキシコロジー「はじめに」.; 医学のあゆみ , 259 , 215- (2016)
• 原著論文3: 小島佳奈子，斉藤春五，渡邉昌俊.; ナノトキシコロジーにおけるin vitro評価試験：現状と将来.; 医学のあゆみ , 259 , 255-260 (2016)
• 原著論文4: K. Kojima, S. Takahashi, S. Saito,et al.; Combined effects of Fe3O4 nanoparticles and chemotherapyeutic agents on prostate cancer cells in vitro.; Appl. Sci , 8 , 134- (2018); doi.org/10.3390/app8010134
• 原著論文5: K. Hayashi, T. Maruhashi, W. Sakamoto, T. Yogo.; One-pot synthesis of dual stimulus-responsive degradable hollow hybrid nanoparticles for image-guided trimodal therapy.; Adv. Funct. Mater. , 26 , 8613-8622 (2016); DOI: 10.1002/adfm.201603394
• 原著論文6: K. Hayashi.; Multifunctional hybrid nanoparticles for biomedical applications.; J. Ceram. Soc. Jpn. , 124 , 855-862 (2016); http://dx.doi.org/10.2109/jcersj2.16099
• 原著論文7: K. Hayashi, Y. Sato, H. Maruoka, et al.; Organic-inorganic hybrid nanoparticles for tracking the same cells seamlessly at the cellular, tissue, and whole body levels.; ACS Biomater. Sci. & Engin. , 3 , 1129-1135 (2017); DOI:10.1021/acsbiomaterials.7b00181
• 原著論文8: K. Hayashi, S. Yamada, H. Hayashi, et al.; Red blood cell-like particles with the ability to avoid lung and spleen accumulation for the treatment of liver fibrosis.; Biomater. , 156 , 45-55 (2018); DOI:10.1016/j.biomaterials.2017.11.031
• 原著論文9: H. Miki, S. Nakamura, A. Oda, H. Tenshin,et al.; Effective impairment of myeloma cells and their progenitors by hyperthermia.; Oncotarget , 9 , 10307-10316 (2018); DOI:10.18632/oncotarget.23121
• 原著論文10: M. Komiya, G. Fujii, S. Miyamoto,et al.; Suppressive effects of the NADPH oxidase inhibitor apocynin on intestinal tumorigenesis in obese KK-Ay and Apc mutant Min mice.; Cancer Sci. , 106 , 1499-1505 (2015); DOI:10.1111/cas.12801
• 原著論文11: T. Kato , T. Toyooka, Y. Ibuki, et al.; Effect of physicochemical character differences on the genotoxic potency of Kaolin.; Genes Environ. , 39 , 12- (2017); DOI:10.1186/s41021-017-0075-y
• 原著論文12: N. Akiba,K. Shiizaki, Y. Matsushima,et al.; nfluence of GSH S-transferase on the mutagenicity induced by dichloromethane and 1,2-dichloropropane.; Mutagenesis , 32 , 455-462 (2017); DOI:10.1093/mutage/gex014
• 原著論文13: E. Fukai, H. Sato, M. Watanabe, et al.; Establishment of an in vivo simulating co-culture assay platform for genotoxicity of multi-walled carbon nanotubes.; Cancer Sci. , 109 , 1024-1031 (2018); DOI:10.1111/cas.13534
• 原著論文14: T. Toyoda, Y. Totsuka, K. Matsushita, et al.; γ-H2AX formation in the urinary bladder of rats treated with two norharman derivatives obtained from o-toluidine and aniline.; J. Application. Toxicol. , 38 , 537-543 (2018); DOI:10.1002/jat.3560
• 原著論文15: T. Fujitani, A. Inomata, A. Ogata, et al.; Comparison of fetal toxicity of various multi-wall carbon nanotubes in mice.; Toxicol. Rep. , 2 , 1404-1408 (2015); https://doi.org/10.1016/j.toxrep.2015.07.014
• 原著論文16: K. Horibata, A. Ukai, A. Ogata,et al.; Absence of in vivo mutagenicity of multi-walled carbon nanotubes in single intratracheal instillation study using F344 gpt delta rats.; Genes Environ. , 39 , 4- (2017); doi: 10.1186/s41021-016-0065-5
• 原著論文17: M.Usami, M. Takamatsu, S. Kazama, K. et al.; Proteomic analysis of valproic-acid–induced embryotoxicity in cultured post-implantation rat embryos.; Fundam. Toxicol. Sci. , 4 , 31-35 (2018); https://doi.org/10.2131/fts.4.31
• 原著論文18: N. Hanagata, H. Morita.; Calcium ions rescue human lung epithelial cells from the toxicity of zinc oxide nanoparticles.; J. Toxicol. Sci. , 40 , 625-635 (2015); DOI:10.2131/jts.40.625

公開日・更新日

• 公開日: 2018-06-04
• 更新日: 2022-06-10

収支報告書

• 文献番号: 201725003Z
• 報告年月日: 2019年06月10日

収入

• (1)補助金交付額: 12,300,000円
• (2)補助金確定額: 12,300,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	5,960,136円
		人件費・謝金	1,226,962円
		旅費	708,924円
		その他	1,565,978円
	間接経費		2,838,000円
	合計		12,300,000円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2019-05-29
• 更新日: -