既存添加物の安全性確保のための規格基準設定に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201622001A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 既存添加物の安全性確保のための規格基準設定に関する研究
• 課題番号: H26-食品-一般-001
• 研究年度: 平成28(2016)年度
• 研究代表者(所属機関): 穐山 浩(国立医薬品食品衛生研究所 食品部)

研究分担者(所属機関)

• 天倉　吉章(松山大学　薬学部)
• 多田　敦子(国立医薬品食品衛生研究所　食品添加物部)
• 杉本　直樹(国立医薬品食品衛生研究所　食品添加物部)
• 受田　浩之(高知大学 教育研究部総合科学系生命環境医学部門)
• 井之上　浩一(立命館大学　薬学部)
• 永津　明人(金城学院大学　薬学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成26(2014)年度
• 研究終了予定年度: 平成28(2016)年度
• 研究費: 10,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

国の成分規格が設定されていない既存添加物約140品目について，流通実態や今後の成分規格作成の技術的実現性を調査研究し，今後の成分規格作成の優先順序を判断する．また今後の規格設定が可能と考えられる品目については，含有成分の解析と基原確認及び成分規格試験法の検討を進める．また規格試験として，酸化防止剤には抗酸化活性測定法の導入を検討し，酸化防止剤の規格試験法素案を作成する．また日持ち向上剤,苦味料，増粘剤等，複雑な混合物の品目に関しても特性値を指標とした規格試験法の開発を模索する．また第9版公定書に収載予定の酵素の基原に関しては，種の同定に至っていない菌種があることから，種の同定を解析する方法を確立する．

研究方法

既存添加物の流通状況、安全性試験実施状況、成分規格の整備状況を調査した。成分規格未設定の品目について含有成分を解析した。有効成分(指標成分)の標準品設定のため、定量NMRを利用した純度検定等を行った。公的な規格試験法に利用できる抗酸化活性標準操作法の確立を検討した。DPPH法による酸化防止剤評価方法を確立し，含有成分が多種のため分離分析が困難な酸化防止剤の抗酸化活性評価を実施し、活性成分含有量との比較を行った。日持ち向上剤や増粘剤等に関して物理的特性値等を指標とした規格試験法の開発を検討する。第9版公定書に収載予定の酵素の基原に関しては、種の同定に至っていない菌種があることから、種の同定を解析する方法を確立する。

結果と考察

「生コーヒー豆抽出物」について，5-O-Caffeoylquinic acid（クロロゲン酸），Caffeineをはじめとする13種の化合物を単離，同定した．「ムラサキイモ色素」「ムラサキイモ」「ムラサキヤマイモ」：最大吸収波長（ムラサキイモ：515～535 nm，ムラサキヤマイモ： 525～545 nm）によるピークが全く異なっており，それぞれの成分を同定する必要があった．そのため，LC-MSによって，各ピークの同定を実施することとした．ムラサキイモ由来成分は，cyanidin， penidin， peonidinなどの配糖体であり，ムラサキヤマイモ由来成分は，Alatanin類の異性体混合であった．「ゴマ油不けん化物」：汎用的な逆相系クロマトグラフィーを用いたゴマ油不けん化物中のセサモリン，セサミン，セサモール（分解物）の一斉分析法の構築を行った．「ヤマモモ抽出物」においてmyricitrin,「グルコサミン」においてglucosamine，「クローブ抽出物」においてeugenolを1H-qNMRを用いて定量する条件を確立した.「クチナシ青色素」：ゲニピンとベンジルアミンを用いたモデル実験をおこなった．異なる混合比の反応実験から，青色素本体がゲニピンと一級アミンがモル比1：1で反応したユニットの繰り返し構造であることが示唆された．既存添加物の酸化防止剤の一般試験法としてDPPH法を提案し，その具体案を作成した．生コーヒー豆抽出物のDPPHラジカル消去活性を測定したところ，5-O-Caffeoylquinic acid等のカフェー酸誘導体の添加物活性への寄与が大きいことが示唆された．カワラヨモギ抽出物の成分規格案確立のため，HPLC分析法を検討し，国内流通製品の品質確保の指標となる成分について確認した．既存添加物アルギン酸リアーゼの生産菌の一種であるFlavobacterium multivorumについて，種の同定解析を検討した．Flavobacterium属に帰属されるものの，相同性が98.7%以上，すなわち，同種である可能性が考慮される既知種は検索されなかった．従って，本同定解析ではFlavobacterium sp.と推定されることが判明した．

結論

第9版食品添加物公定書に未収載の既存添加物の中から，第10版公定書の作成に備え検証規格の作成を実施した．「生コーヒー豆抽出物」，「カンゾウ油性抽出物」，「カキ色素」，「アンモニア処理ラック色素」，「ゴマ油不ケン化物」，「ヤマモモ抽出物」,「グルコサミン」，「グローブ抽出物」，「クチナシ青色素」, 「カワラヨモギ抽出物」「ベニコウジ色素」等の成分解析行い、一部は規格試験法案を確立した．既存添加物に分類される酸化防止剤の抗酸化力価評価に関する一般試験法案を作成し, DPPH法に基づく一般試験法案が酸化防止剤の力価評価において広い適用性と高い再現性を示すことが明らかとなった．第9版公定書に収載される既存添加物酵素の微生物由来の基原について，16S rDNAまたはITS配列が国際塩基配列データベースGenBankに登録されているのか調査した．基原の使用に関しては一定の判断基準を設定しておく必要があると思われる．

公開日・更新日

• 公開日: 2017-07-04
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201622001B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 既存添加物の安全性確保のための規格基準設定に関する研究
• 課題番号: H26-食品-一般-001
• 研究年度: 平成28(2016)年度
• 研究代表者(所属機関): 穐山 浩(国立医薬品食品衛生研究所 食品部)

研究分担者(所属機関)

• 天倉　吉章(松山大学　薬学部)
• 多田　敦子(国立医薬品食品衛生研究所　食品添加物部)
• 杉本　直樹(国立医薬品食品衛生研究所　食品添加物部)
• 受田　浩之(高知大学　教育研究部総合科学系生命環境医学部門)
• 井之上　浩一(立命館大学　薬学部)
• 永津　明人(金城学院大学　薬学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成26(2014)年度
• 研究終了予定年度: 平成28(2016)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

国の成分規格が設定されていない既存添加物約140品目について，流通実態や今後の成分規格作成の技術的実現性を調査研究し，今後の成分規格作成の優先順序を判断する．また今後の規格設定が可能と考えられる品目については，含有成分の解析と基原確認及び成分規格試験法の検討を進める．また規格試験として，酸化防止剤には抗酸化活性測定法の導入を検討し，酸化防止剤の規格試験法素案を作成する．また日持ち向上剤や増粘剤等，複雑な混合物の品目に関しても特性値を指標とした規格試験法の開発を模索する．また第9版公定書に収載予定の酵素の基原に関しては，種の同定に至っていない菌種があることから，種の同定を解析する方法を確立する．

研究方法

既存添加物の流通状況、安全性試験実施状況、成分規格の整備状況を調査した。成分規格未設定の品目について含有成分を解析した。有効成分(指標成分)の標準品設定のため、定量NMRを利用した純度検定等を行った。公的な規格試験法に利用できる抗酸化活性標準操作法の確立を検討した。DPPH法による酸化防止剤評価方法を確立し，含有成分が多種のため分離分析が困難な酸化防止剤の抗酸化活性評価を実施し、活性成分含有量との比較を行った。日持ち向上剤に関して物理的特性値等を指標とした規格試験法の開発を検討した。第9版公定書に収載される既存添加物酵素の微生物由来の基原について5つの群に分類した．GenBank上の16S rDNAまたはITS1塩基配列情報の登録の有無の確認を行った．

結果と考察

「カンゾウ油性抽出物」:流通製品について、未同定であった4種の抗酸化活性寄与成分を単離・精製し、各種解析結果から構造を明らかにした。また、これら4成分のDPPHラジカル消去能を調査し、その比活性を明らかにした。「ゴマ油不ケン化物」：日本食品添加物協会第4版自主規格における確認試験を見直し、主成分をセサミン及びセサモリンとした逆相系LC法の構築とHSCCCによる単離精製（標準品の獲得）を達成した. 「クチナシ青色素」：色調変化を観察すると共に青色素B1及びB2を単離しその構造を推定した結果, 青色素B1及びB2は, 前駆体である黄色素Y1及びY2が繰り返し重合した化合物であると推定された. 既存添加物の酸化防止剤の一般試験法としてDPPH法を提案し，その具体案を作成した．「生コーヒー豆抽出物」のDPPHラジカル消去活性を測定したところ，5-O-Caffeoylquinic acid等のカフェー酸誘導体の添加物活性への寄与が大きいことが示唆された．「アンモニア処理ラック色素」の成分分析を行った。INADEQUATEをはじめとするNMR解析およびLC/MS分析の結果、アンモニア処理ラック色素は、4位のヒドロキシ基にアミノ基が置換した4-アミノラッカイン酸類を主色素成分とすることが確認された.「カワラヨモギ抽出物」の成分規格案確立のため，HPLC分析法を検討し，国内流通製品の品質確保の指標となる成分について確認した．最新の研究により, 学名が変更された既存添加物酵素の生産菌（基原）があるというが判明した. 本研究では, 当該生産菌の種名変更に関わる情報に関する問題点を整理し, 解決策として種名管理手法の素案を作成した.

結論

第9版食品添加物公定書に未収載の既存添加物の中から，第10版公定書の作成に備え検証規格の作成を実施した．「生コーヒー豆抽出物」，「カンゾウ油性抽出物」，「カキ色素」，「アンモニア処理ラック色素」，「ゴマ油不ケン化物」，「グローブ抽出物」，「クチナシ青色素」、「カワラヨモギ抽出物」等の成分解析行い、一部は規格試験法案を確立した．既存添加物に分類される酸化防止剤の抗酸化力価評価に関する一般試験法案を作成し, DPPH法に基づく一般試験法案が酸化防止剤の力価評価において広い適用性と高い再現性を示すことが明らかとなった．第9版公定書に収載される既存添加物酵素の微生物由来の基原について，16S rDNAまたはITS配列が国際塩基配列データベースGenBankに登録されているのか調査した．基原の使用に関しては一定の判断基準を設定しておく必要があると思われる．

公開日・更新日

• 公開日: 2017-07-04
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201622001C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 国際単位系（SI）に計量的にトレーサブルな定量法として定量NMR法を実用化し、絶対純度が値付けされた定量用標準品の供給、さらにこれを用いた信頼性の高い分析法の開発が期待される。
• 臨床的観点からの成果: なし
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: 基礎的検討及び新技術導入と共に既存添加物の規格試験法設定に関する研究を先導的に進めることができ、得られた成果を業界と調整することで、規格設定が困難な品目の成分規格作成を推進することが期待できる。
• その他のインパクト: 分子生物学的手法を用いて酵素基原の菌種を解析することにより、酵素の基原を明確化することが可能となる。

発表件数

• 原著論文（和文）: 6件
• 原著論文（英文等）: 32件
• その他論文(和文): 1件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 32件
• 学会発表(国際学会等): 4件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Amakura Y., Yoshimura M., Yoshida T., et al.; Chromatographic evaluation of the components of grape skin extract used as food additives; Jpn. J. Food Chem. Safety , 22 , 108-114 (2015)
• 原著論文2: Amakura Y., Yoshimura M., Morimoto S.et al.; Chromatographic evaluation and characterization of components of gentian root extract used as food additives; Chem. Pharm. Bull. , 64 , 78-85 (2016); 10.1248/cpb.c15-00776.
• 原著論文3: Kawasaki H., Akiyama T., Tada A. et al.; Development of HILIC-LC/MS method for direct quantitation of 2-acetyl-4-tetrahydroxybutylimidazole in caramel III with the qNMR certified standard; Jpn. J. Food Chem. Safety , 22 , 115-122 (2015)
• 原著論文4: Nishizaki Y., Ishizuki K., Akiyama H. et al.; Preparation of ammonia-treated lac dye and structure elucidation of its main component; Shokuhin Eiseigaku Zasshi (Food Hyg. Saf. Sci.) , 57 , 193-200 (2015); 10.3358/shokueishi.57.193
• 原著論文5: Tada A., Ishizuki K., Yamazaki T. et al.; Method for the Determination of Natural Ester-Type Gum Bases Used as Food Additives via Direct Analysis of their Constituent Wax Esters Using High-Temperature GC/MS; ood Science & Nutrition , 2 , 417-425 (2014); 10.1002/fsn3.117
• 原著論文6: Tanaka R., Nitta A., Nagatsu A. ; Application of a quantitative 1H-NMR method for the determination of amigdalin in Persica semen, Armeniaca semen and Mume fructus; Journal of Natural Medicines , 68 (1) , 225-230 (2014); 10.1007/s11418-013-0783-y
• 原著論文7: Tanaka R., Hasebe Y., Nagatsu A.; Application of a quantitative 1H-NMR method for the determination of gentiopicroside in Gentianae radix and Gentianae scabrae radix; Journal of Natural Medicines , 68 , 630-635 (2014); 10.1007/s11418-014-0833-0
• 原著論文8: Tanaka R., Shibata H., Sugimoto N. et al.; Application of a quantitative 1H-NMR method for the determination of paeonol in Moutan cortex, Hachimijiogan and Keishibukuryogan; Journal of Natural Medicines , 70 (4) , 797--802 (2016); 10.1007/s11418-016-1003-3
• 原著論文9: Tanaka R., Inagaki R., Sugimoto N. et al.; Application of a quantitative 1H-NMR (1H-qNMR) method for the determination of geniposidic acid and acteoside in Plantaginis semen; Journal of Natural Medicines , 71 (1) , 315-320 (2017); 10.1007/s11418-016-1040-y
• 原著論文10: Inoue K., Tanada C., Nishikawa H. et al.; Evaluation of Gardenia Yellow using crocetin from alkaline hydrolysis based on ultra high-performance liquid chromatography and high-speed countercurrent chromatography; J. Sep. Sci. , 37 , 3619-3624 (2014); 10.1002/jssc.201400793
• 原著論文11: Takahashi M., Nishizaki Y., Sugimoto N. et al.; Determination and purification of sesamin and sesamolin in sesame seed oil unsaponified matter using reversed-phase liquid chromatography coupled with photodiode array and tandem mass spectrometry and high-speed countercurrent chromatography; J. Sep. Sci. , 39 , 3898-3905 (2016); 10.1002/jssc.201600723
• 原著論文12: Todoroki, K., Nakamura, M., Sato, Y.et al.; 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin -2-yl) -4-methylmorpholinium Chloride as an Enantioseparation Enhancer for Chiral Derivatization-LC Analysis of D- and L-Amino acids.; Chromatography , 37 , 23-28 (2016)
• 原著論文13: Shimamura T., Sumikura Y., Yamazaki T.et al.; Applicability of DPPH Assay for Evaluation of Antioxidant Capacity of Food Additives -Inter-laboratory Evaluation Study-; Analytical Sciences , 30 , 717-721 (2014); 10.2116/analsci.30.717
• 原著論文14: Akiyama H, Nose M, Ohtsuki N.et al.; Evaluation of the safety and efficacy of extracts of Glycyrrhiza uralensis roots produced using artificial hydroponic and artificial hydroponic-field hybrid cultivation system; J. Nat. Med. , 71 , 265-271 (2017); 10.1007/s11418-016-1058-1
• 原著論文15: Inoue, K., Miyazaki, Y., Unno, K.et al.; Stable isotope dilution HILIC-MS/MS method for accurate quantification of glutamic acid, glutamine, pyroglutamic acid, GABA and theanine in mouse brain tissues; Biomed. Chromatogr , 30 , 55-61 (2016); 10.1002/bmc.3502
• 原著論文16: Min JZ, Tomiyasu Y, Morotomi T.et al.; First observation of N-acetyl leucine and N-acetyl isoleucine in diabetic patient hair and quantitative analysis by UPLC-ESI-MS/MS; Clin Chim Acta. , 444 , 143-148 (2015); 10.1016/j.cca.2015.02.006
• 原著論文17: Inoue K, Tanada C, Sakamoto T,et al.; Metabolomics approach of infant formula for the evaluation of contamination and degradation using hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with mass spectrometry.; Food Chem , 181 , 318-324 (2015); 10.1016/j.foodchem.2015.02.117
• 原著論文18: Ueda T., Okumura T., Tanaka Y.et al.; New Electrochemical Evaluation of the Antioxidant Capacity of Beverages with Polyoxometalates as Redox Probes.; Analytical Sciences , 32 , 825-830 (2016); 10.2116/analsci.32.825
• 原著論文19: Enkhtuya E., Shimamura T, Kashiwagi T.etal.; Antioxidative Constituents in the Leaves of Paeonia anomala Grown in Mongolia; Food Science and Technology Research , 23 , 63-70 (2017); 10.3136/fstr.23.63
• 原著論文20: 山内良子, 石井佐弥, 草場悠里 et al.; 酸化防止剤力価評価を目的としたDPPHラジカル消去能測定におよぼす反応溶媒の影響; 日本食品保蔵科学会誌 , 42 , 189-196 (2016)

公開日・更新日

• 公開日: 2017-07-04
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201622001Z
• 報告年月日: 2018年03月15日

収入

• (1)補助金交付額: 10,000,000円
• (2)補助金確定額: 10,000,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	7,774,425円
		人件費・謝金	45,276円
		旅費	688,160円
		その他	1,492,139円
	間接経費		0円
	合計		10,000,000円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2018-06-25
• 更新日: -