遺伝性ミオパチーの次世代型統合的診断拠点形成

文献情報

• 文献番号: 201442081A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 遺伝性ミオパチーの次世代型統合的診断拠点形成
• 課題番号: -
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 西野 一三(独立行政法人 国立精神・神経医療研究センター 神経研究所疾病研究第一部)

研究分担者(所属機関)

• 野口　　悟(独立行政法人　国立精神・神経医療研究センター　神経研究所疾病研究第一部)
• 三橋　里美(独立行政法人　国立精神・神経医療研究センター　神経研究所疾病研究第一部)
• 後藤　雄一(独立行政法人　国立精神・神経医療研究センター　神経研究所疾病研究第二部)
• 石山　昭彦(独立行政法人　国立精神・神経医療研究センター　病院小児神経診療部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 【委託費】 難治性疾患等実用化研究（難治性疾患実用化研究）
• 研究開始年度: 平成26(2014)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究費: 127,038,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

遺伝学的に未診断の遺伝性ミオパチー（ミトコンドリア病を含む）例に対し次世代解析装置を用いて、１）既知遺伝子のハイスループット解析、２）全エクソーム解析、３）変異病原性証明と疾患病態解明、４）遺伝子型と病理所見・画像所見との相関解明、５）国内外の連携を行って、筋疾患の次世代型統合的診断拠点を形成する。

研究方法

(1) 既知遺伝子のハイスループット解析
遺伝性筋疾患既知原因遺伝子群を臨床病理学的特徴より4つのカテゴリーに分類した筋疾患遺伝子パネルを作成し、次世代シークエンサーIonPGMを用いて、網羅的にシークエンス解析を行った。
(2) 全エクソーム解析
全エクソームキャプチャーキットを用いてライブラリーを作製し、HiSeq1000にてゲノム情報を取得した。既に構築済みの解析パイプラインを通して、候補遺伝子を絞り込み、候補遺伝子変異は、サンガー法で確認した。
(3) 新規原因遺伝子変異の病原性証明と疾患分子病態解明
α-dystroglycanopathy (aDGP)について、POMGNT2遺伝子を欠失した半数体株化細胞HAP1に対して、変異または野生型POMGNT2 cDNAを導入した。Tubular aggregate myopathy (TAM)については、見出したORAI1変異のストア作動性カルシウム流入への影響を確認するため、罹患者由来の筋管細胞及び変異型ORAI1を過剰発現させたHEK293細胞を用いて、細胞外Ca2+濃度変化に伴う細胞内Ca2+濃度変化を測定した。
(4) 病理・画像所見解析
国立精神・神経医療研究センター（NCNP）脳病態統合イメージングセンターが開発したWeb上での画像登録、閲覧が可能なシステムIBISS（Integrative Brain Imaging Support System）を用い、2005年1月以降の例で遺伝学的未確定なミオパチー例の骨格筋画像、ミトコンドリアミオパチーの脳画像の登録を行った。
早期呼吸障害を伴う遺伝性ミオパチー（Hereditary myopathy with early respiratory failure: HMERF）14家系17例の筋病理所見の再検討を行った。
(5) 国内外の連携
国内外の検体を受け入れて解析するとともに、海外からの研修受け入れおよびアウトリーチ活動を行った。

結果と考察

(1) 既知遺伝子のハイスループット解析
約25%の症例で原因と考えられる遺伝子変異を同定することができた。診断が確定できなかった症例については、エクソームシークエンスを行い、さらなる解析を行う。
(2) 全エクソーム解析
これまでにエクソーム解析を行った475例中350例で、解析が終了している。このうち、60の症例で原因遺伝子変異を見出した。特に、TAMの新規原意遺伝子ORAI1の同定、世界第2例目となるDAG1変異例を同定、新規ネマリンミオパチー原因遺伝子LMOD3の同定、TK2変異による筋線維未熟性を伴う先天性ミオパチーの同定、中心核ミオパチーの新規原因遺伝子同定、LMNA変異による核内ロッドミオパチーの同定、本邦初のMEGF10ミオパチー同定、本邦初のANO5変異同定、などの成果を上げた。
(3) 新規原因遺伝子変異の病原性証明と疾患分子病態解明
aDGPに関しては、野生型cDNA導入により、失われていた細胞のIIH6抗体での染色性が回復したことから、当該遺伝子変異が病的変異であることを確定した。TAMに関しては、細胞外にCa2+を加えることで、変異ORAI1をもつ細胞では有意に細胞内Ca2+濃度が上昇し、ORAI1チャネルの特異的阻害剤により抑制されたことから、ORAI1優性変異による恒常的SOCE活性化が、TAMの原因であることが確定した。
(4) 病理・画像所見解析
遺伝学的未診断例の遺伝性ミオパチー47例の骨格筋画像と、ミトコンドリアミオパチー12例の脳画像を登録した。HMERFについては、筋病理所見を再検討した結果、cytoplasmic bodyが筋線維内でネックレス状に配列する所見（necklace cytoplasmic body）が感度82%、特異度99%と極めて優れた筋病理学的マーカーであることが明らかとなった。
(5) 国内外の連携
2014年には827件の筋病理診断を行った。タイ、中国、韓国から医師を受け入れた。また海外各地での筋疾患診療支援活動を行った。

結論

次世代解析装置による網羅的遺伝子解析と既に世界最高峰レベルにある筋疾患病理診断と組み合わせることで、より高度な次元の統合的診断を提供しつつある。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-22
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201442081C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 遺伝性筋疾患既知原因遺伝子群を臨床病理学的特徴より4つのカテゴリーに分類した筋疾患遺伝子パネルを作成し、約25%の例で原因遺伝子変異を同定した。全エクソーム解析では、60例で原因遺伝子変異を見出し、TAMの新規原意遺伝子ORAI1の同定、世界第2例目となるDAG1変異例同定、新規ネマリンミオパチー原因遺伝子LMOD3同定、TK2変異による筋線維未熟性ミオパチー同定、中心核ミオパチー新規原因遺伝子同定、LMNA変異核内ロッドミオパチー同定、などの成果を上げた。
• 臨床的観点からの成果: 新たな原因遺伝子同定および変異同定は遺伝カウンセリングで極めて重要な意義を持つ。本邦筋生検の8割近くを占めると考えられる827件の筋病理診断に加えて、次世代解析技術を応用した遺伝子診断を提供した。アジアを中心とする海外各地からの検体を受け入れるとともに、筋疾患診療を支援するべくアウトリーチ活動を行った。希少疾病であり専門家・専門施設の少ない筋疾患について、国内外の臨床の現場を後方支援している。
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: 希少疾病である筋疾患のフィールドで国際協力を行った。
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 20件
• その他論文(和文): 1件
• その他論文(英文等): 2件
• 学会発表(国内学会): 15件
• 学会発表(国際学会等): 31件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 2件 ; イルミナゲノムサミット2015、第11回長野県希少難病治療研究会

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Uruha A, Hayashi YK, Oya Y,et al.; Necklace cytoplasmic bodies in hereditary myopathy with early respiratory failure; J Neurol Neurosurg Psychiatry , 86 (5) , 483-489 (2014); 10.1136/jnnp-2014-309009
• 原著論文2: Yonekawa T, Nishino I; Ullrich congenital muscular dystrophy: clinicopathological features, natural history and pathomechanism(s); J Neurol Neurosurg Psychiatry , 86 (3) , 280-287 (2015); 10.1136/jnnp-2013-307052
• 原著論文3: Tanboon J, Hayashi YK, Nishino I, et al.; Kyphoscoliosis and easy fatigability in a 14-year-old boy; Neuropathology , 35 (1) , 91-93 (2015); 10.1111/neup.12147
• 原著論文4: Endo Y, Noguchi S, Hara Y, et al.; Dominant mutations in ORAI1 cause tubular aggregate myopathy with hypocalcemia via constitutive activation of store-operated Ca2+ channels; Hum Mol Genet , 24 (3) , 637-648 (2015); 10.1093/hmg/ddu477
• 原著論文5: Dong M, Noguchi S, Endo Y,et al.; DAG1 mutations associated with asymptomatic hyperCKemia and hypoglycosylation of α-dystroglycan; Neurology , 84 (3) , 273-279 (2015); 10.1212/WNL.0000000000001162
• 原著論文6: Cho A, Hayashi YK, Monma K,et al.; Mutation profile of the GNE gene in Japanese patients with distal myopathy with rimmed vacuoles (GNE myopathy); J Neurol Neurosurg Psychiatry , 85 (8) , 912-915 (2014); 10.1136/jnnp-2013-305587
• 原著論文7: Miyatake S, Koshimizu E, Hayashi YK,et al.; Deep sequencing detects very-low-grade somatic mosaicism in the unaffected mother of siblings with nemaline myopathy; Neuromuscul Disord , 24 (7) , 642-647 (2014); 10.1016/j.nmd.2014.04.002
• 原著論文8: Kajino S,Noguchi S,Nishino I,et al.; Congenital fiber type disproportion myopathy caused by LMNA mutations; J Neurol Sci , 340 (1-2) , 94-98 (2014); 10.1016/j.jns.2014.02.036
• 原著論文9: Goto M,Noguchi S, Nonaka I,et al.; A nationwide survey on marinesco-sjogren syndrome in Japan; Orphanet J Rare Dis , 9 (1) , 58- (2014); 10.1186/1750-1172-9-58
• 原著論文10: Okubo M, Noguchi S, Mitsuhashi S,et al.; Genetic diagnosis of Duchenne/ Becker muscular dystrophy using next-generation sequencing: validation analysis of DMD mutations; J Hum Genet , 61 (6) , 483-489 (2016); 10.1038/jhg.2016.7.
• 原著論文11: Matsuda C, Kiyosue K, Nishino I,et al.; Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair; PLoS Curr , Online (2015); 10.1371/currents.md.5865add2d766f39a0e0411d38a7ba09c
• 原著論文12: Endo Y, Dong M, Noguchi S,et al.; Milder forms of muscular dystrophy associated with POMGN2 mutations; Neurol Genet , 1 (4) (2015); 10.1212/NXG.0000000000000033
• 原著論文13: Liang WC, Zhu WH, Mitsuhashi S,et al.; Congenital muscular dystrophy with fatty liver and infantile-onset cataract caused by TRAPPC11 mutations; Skeletal Muscle , 5 (29) (2015); 10.1186/s13395-015-0056-4
• 原著論文14: Takayama K, Nonaka I, Nishino I,et al.; Japanese multiple epidermal growth factor 10 (MEGF10) myopathy with novel mutations: A phenotype-genotype correlation; Neuromuscul Disord , 26 (9) , 604-609 (2016); 10.1016/j.nmd.2016.06.005
• 原著論文15: Termglinchan T,Mitsuhashi S, Nishino I,et al; Novel TK2 mutations as a cause of delayed muscle maturation in mtDNA depletion syndrome; Neurol Genet , 2 (5) , e95- (2106); 10.1212/NXG.0000000000000095
• 原著論文16: Miyatake S,Nonaka I, Nishino I,et al; Biallelic Mutations in MYPN, Encoding Myopalladin, Are Associated with Childhood-Onset, Slowly Progressive Nemaline Myopathy; Am J Hum Genet , 100 (1) , 169-178 (2017); 10.1016/j.ajhg.2016.11.017
• 原著論文17: Liang WC, Tian X,Nishino I,et al; Comprehensive target capture/ next-generation sequencing as a second-tier diagnostic approach for congenital muscular dystrophy in Taiwan; PLoS One , 12 (2) , e0170517- (2107); 10.1371/journal.pone.0170517
• 原著論文18: Zhu W, Mitsuhashi S, Nishino I,et al; Missing genetic variations in GNE myopathy: rearrangement hotspots encompassing 5’UTR and founder allele; J Hum Genet , 62 (2) , 159-166 (2017); 10.1038/jhg.2016.134
• 原著論文19: Nishikawa A, Mitsuhashi S,Nishino I,et al; Targeted massively parallel sequencing and histological assessment of skeletal muscles for the molecular diagnosis of inherited muscle disorders; J Med Genet , 54 (2) , 104-110 (2017); 10.1136/jmedgenet-2016-104073
• 原著論文20: Inui T, Anzai M, Nishino I ,et al; A novel mutation in the proteolytic domain of LONP1 causes atypical CODAS syndrome; J Hum Genet (2107); 10.1038/jhg.2017.11.

公開日・更新日

• 公開日: 2016-06-13
• 更新日: 2019-06-05

収支報告書

• 文献番号: 201442081Z
• 報告年月日: 2107年05月25日

収入

• (1)補助金交付額: 165,149,000円
• (2)補助金確定額: 165,149,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	116,036,536円
		人件費・謝金	3,226,812円
		旅費	1,317,342円
		その他	6,783,562円
	間接経費		38,111,000円
	合計		165,475,252円

備考

備考

差額の326,252円の消費税相当額分は当センターの自己充当額といたしました。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-22
• 更新日: -