文献情報
文献番号
201432002A
報告書区分
総括
研究課題名
自己骨髄間葉系細胞の磁気ターゲティングによる関節軟骨欠損修復
課題番号
-
研究年度
平成26(2014)年度
研究代表者(所属機関)
越智 光夫(広島大学 大学院医歯薬保健学研究院)
研究分担者(所属機関)
- 田中 純子(広島大学 大学院医歯薬保健学研究院 )
- 安達 伸生(広島大学 病院)
- 味八木 茂(広島大学 病院)
- 亀井 直輔(広島大学 病院)
- 中前 敦雄(広島大学 大学院医歯薬保健学研究院 )
- 石川 正和(広島大学 病院)
- 中佐 智幸(広島大学 病院)
- 菅原 桂(株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング)
- 柳田 忍(株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 【委託費】 再生医療実用化研究
研究開始年度
平成26(2014)年度
研究終了予定年度
平成26(2014)年度
研究費
46,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
低侵襲で有効性の高い治療として、MRI用造影剤として使用されているナノ鉄粒子であるフェルカルボトランを細胞質に取り込ませて磁性化した骨髄間葉系細胞を関節内に注射し、体外から磁場によって細胞を軟骨欠損部へと誘導・集積させる磁気ターゲッティング法を開発した。ミニブタを用いた前臨床試験によって軟骨修復における有効性を確認し、さらに臨床試験開始のために必要なヒト磁性化骨髄間葉系細胞の品質・安全性評価も終了した。
本研究では外傷性損傷あるいは離断性骨軟骨炎に起因する膝関節軟骨損傷を対象として磁性化自己骨髄間葉系細胞の磁気ターゲティングの臨床試験を開始し、3年以内に終了する事を目標とする。また、複数のロットのヒト間葉系細胞を用いてサイトカイン・増殖因子・マイクロRNA発現のプロファイリングを行い、ペレットカルチャーやコロニーアッセイなどのin vitro評価系での結果やヌードラットの関節軟骨欠損モデルへの移植による軟骨修復効果のLot間比較を行って、軟骨修復に関与する液性因子の同定と品質基準の策定を行う。
本研究では外傷性損傷あるいは離断性骨軟骨炎に起因する膝関節軟骨損傷を対象として磁性化自己骨髄間葉系細胞の磁気ターゲティングの臨床試験を開始し、3年以内に終了する事を目標とする。また、複数のロットのヒト間葉系細胞を用いてサイトカイン・増殖因子・マイクロRNA発現のプロファイリングを行い、ペレットカルチャーやコロニーアッセイなどのin vitro評価系での結果やヌードラットの関節軟骨欠損モデルへの移植による軟骨修復効果のLot間比較を行って、軟骨修復に関与する液性因子の同定と品質基準の策定を行う。
研究方法
１．関節軟骨損傷患者を対象とした臨床研究
方法：
1) 骨髄液の採取：
局所麻酔下に被験者の腸骨より約30mLの自己骨髄液の採取を行う。
2) 細胞の調製：
骨髄液約30mLに培養液（15%FBS含有DMEM）を加えて、約3週間培養し、1×10^7個以上の間葉系細胞を得る。培養の最終段階で、培地中にフェルカルボトラン（リゾビスト®）を添加し、約12時間反応させた後、細胞を剥離、生理食塩水で2回洗浄する。
3) 骨髄刺激法および骨髄間葉系細胞の移植手術：
被験者に対して関節鏡下に関節軟骨欠損部に骨髄刺激法を施行し、軟骨欠損部の反対側に磁場発生装置を設置して磁性化した自己骨髄間葉系細胞を関節内に注入し、磁場に暴露したまま10分間静置した後、創部を縫合し手術を終了する。
目標被験者数： 5例
研究期間：
承認日から3年（被験者登録期間2年および経過観察期間1年）
主要評価項目：
有害事象（種類、重症度、発現頻度、発現期間および因果関係）
副次評価項目：
臨床症状（スコアリング）、MRI、局所単純X線
２．間葉系細胞の液成因子プロファイリングによる品質評価基準の策定
i) 液性因子のプロファイリング
ヒト骨髄間葉系細胞（異なる5ロット）を用いて、マイクロアレイ、マイクロRNAアレイおよびELISAによるサイトカイン・増殖因子・マイクロRNA発現のプロファイリングを行う。
ii) 分化・増殖のin vitro評価
骨髄間葉系細胞の軟骨分化と増殖のin vitro評価系として、各ロットの間葉系細胞のペレットカルチャーとコロニーアッセイを行う。
方法：
1) 骨髄液の採取：
局所麻酔下に被験者の腸骨より約30mLの自己骨髄液の採取を行う。
2) 細胞の調製：
骨髄液約30mLに培養液（15%FBS含有DMEM）を加えて、約3週間培養し、1×10^7個以上の間葉系細胞を得る。培養の最終段階で、培地中にフェルカルボトラン（リゾビスト®）を添加し、約12時間反応させた後、細胞を剥離、生理食塩水で2回洗浄する。
3) 骨髄刺激法および骨髄間葉系細胞の移植手術：
被験者に対して関節鏡下に関節軟骨欠損部に骨髄刺激法を施行し、軟骨欠損部の反対側に磁場発生装置を設置して磁性化した自己骨髄間葉系細胞を関節内に注入し、磁場に暴露したまま10分間静置した後、創部を縫合し手術を終了する。
目標被験者数： 5例
研究期間：
承認日から3年（被験者登録期間2年および経過観察期間1年）
主要評価項目：
有害事象（種類、重症度、発現頻度、発現期間および因果関係）
副次評価項目：
臨床症状（スコアリング）、MRI、局所単純X線
２．間葉系細胞の液成因子プロファイリングによる品質評価基準の策定
i) 液性因子のプロファイリング
ヒト骨髄間葉系細胞（異なる5ロット）を用いて、マイクロアレイ、マイクロRNAアレイおよびELISAによるサイトカイン・増殖因子・マイクロRNA発現のプロファイリングを行う。
ii) 分化・増殖のin vitro評価
骨髄間葉系細胞の軟骨分化と増殖のin vitro評価系として、各ロットの間葉系細胞のペレットカルチャーとコロニーアッセイを行う。
結果と考察
臨床研究の対象症例の登録を開始し、平成27年2月6日に第1例目の手術治療を行った。約30mlの骨髄を採取でき、プロトコールに沿って培養を行ったところ、約2週間の培養で1×10^7個以上の間葉系細胞を獲得でき、手術前日にフェルカルボトランによる磁性化を開始し、出荷前に顕微鏡で視野内のすべての細胞が磁性化されていることを確認した。無菌試験、マイコプラズマ否定試験、エンドトキシン試験はすべて陰性であった。また、フローサイトメトリーでは90%以上がCD44およびCD105陽性であった。手術では、まず関節鏡視下に左膝の剥離していた軟骨片をリフレッシュし、骨髄刺激法（マイクロフラクチャー）を行った。次に磁場発生装置を設置し、関節鏡視下に軟骨損傷部を確認しながら、磁性化間葉系細胞を膝関節内へ注入した。注入した細胞のほとんどは拡散することなく軟骨欠損部へ留まっていた。
２．間葉系細胞の液成因子プロファイリングによる品質評価基準の策定
i) 液性因子のプロファイリング
5種類の異なるロットのヒト骨髄間葉系細胞からRNAを抽出し、またコントロールとしてヒト皮膚線維芽細胞からもRNAを抽出し、を行った。
ii) 分化・増殖のin vitro評価
軟骨分化の評価として、5種類の異なるロットのヒト骨髄間葉系細胞を用いてペレットカルチャーを行った。
２．間葉系細胞の液成因子プロファイリングによる品質評価基準の策定
i) 液性因子のプロファイリング
5種類の異なるロットのヒト骨髄間葉系細胞からRNAを抽出し、またコントロールとしてヒト皮膚線維芽細胞からもRNAを抽出し、を行った。
ii) 分化・増殖のin vitro評価
軟骨分化の評価として、5種類の異なるロットのヒト骨髄間葉系細胞を用いてペレットカルチャーを行った。
結論
「自己骨髄間葉系細胞の磁気ターゲティングによる関節軟骨欠損修復」の臨床研究の第一例目の治療を開始し、有害事象なく細胞移植治療を行うことができた。また、間葉系細胞由来の液性因子のプロファイリングや軟骨分化・増殖能のin vitro評価系を用いたデータを収集した。
公開日・更新日
公開日
2015-06-01
更新日
-