文献情報
文献番号
201427052A
報告書区分
総括
研究課題名
簡便に調製可能な分子標的気泡を用いた超音波分子イメージングの開発－臨床用超音波造影剤の適応拡大の可能性の検討
課題番号
H25-医薬-若手-023
研究年度
平成26(2014)年度
研究代表者(所属機関)
大谷 健太郎(独立行政法人国立循環器病研究センター 再生医療部)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 【補助金】 医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究
研究開始年度
平成25(2013)年度
研究終了予定年度
平成26(2014)年度
研究費
2,300,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
造影超音波法は、微小気泡を造影剤として用いる非侵襲的かつベッドサイドで施行可能な造影検査法である。近年、抗体やペプチド、タンパクにより修飾した微小気泡を用い、生体内の炎症部位や動脈硬化巣等に気泡を集積させ(分子標的気泡)、それを画像化することで造影超音波法を用いた分子イメージングの開発を目指す試みがなされている。我々はこれまでに、本邦で臨床使用可能な超音波造影剤Sonazoidを基盤とした分子標的気泡の作製の可能性について検討しており、先般、Sonazoidと生体内タンパクMFG-E8(Lactadherin)の複合体が、新生血管や新鮮血栓に対する分子標的気泡になり得ることを見出した。本研究の目的は、担癌モデルマウスを用い、Sonazoid-Lactadherin複合体の新生血管に対する分子標的気泡としての実現可能性について検討することである。併せて、Sonazoid-Lactadherin複合体作製法の簡素化へ向けた、in vitro実験による検討も行う。
研究方法
新生血管(腫瘍血管)に対する分子標的性の検討
4週齢の雌性ヌードマウスの右腹部皮下に、ヒト卵巣線種細胞(SK-OV-3)を5.0×106個移植し、移植7日目(Day7)に造影超音波法にて評価を行った。頸静脈に留置したカテーテルよりSonazoid (1.2×106 bubbles)およびSonazoid-Lactadherin複合体を投与し、投与10分後に超音波装置Aplio(東芝)の1202Sプローブを用いて撮像を行った。音圧はMechanical index 0.4 (AP 9%)とし、視野深度は1cm、焦点位置は腫瘍組織よりも深部とした。Sonazoid-Lactadherin複合体は、既報の方法と同様に、Sonazoid (1.2×108 bubbles, 100μL)とLactadherin 5μg (100μL)を室温で15分反応させて作製した。その後、蒸留水を用いての洗浄と遠心分離操作によって未反応のLactadherinを除去した。
簡便な分子標的気泡作製法の実現に向けたLactadherin定量法の確立
通常、分子標的気泡の調製には洗浄と遠心分離の操作が必須である。しかし今後、洗浄・遠心分離操作が不要な、簡便なSonazoid-Lactadherin複合体の作製を目指すには、気泡溶液中のLactadherin濃度を正確に定量する測定系を確立する必要がある。そこで、Human MFG-E8 Quantikine ELISA Kit (DFGE80, R&D Systems)を用い、本研究で使用しているRecombinant Human MFG-E8 (Lactadherin, 2767-MF, R&D Systems)の測定および、Sonazoid-Lactadherin複合体中のLactadherin濃度について検討を行った。
4週齢の雌性ヌードマウスの右腹部皮下に、ヒト卵巣線種細胞(SK-OV-3)を5.0×106個移植し、移植7日目(Day7)に造影超音波法にて評価を行った。頸静脈に留置したカテーテルよりSonazoid (1.2×106 bubbles)およびSonazoid-Lactadherin複合体を投与し、投与10分後に超音波装置Aplio(東芝)の1202Sプローブを用いて撮像を行った。音圧はMechanical index 0.4 (AP 9%)とし、視野深度は1cm、焦点位置は腫瘍組織よりも深部とした。Sonazoid-Lactadherin複合体は、既報の方法と同様に、Sonazoid (1.2×108 bubbles, 100μL)とLactadherin 5μg (100μL)を室温で15分反応させて作製した。その後、蒸留水を用いての洗浄と遠心分離操作によって未反応のLactadherinを除去した。
簡便な分子標的気泡作製法の実現に向けたLactadherin定量法の確立
通常、分子標的気泡の調製には洗浄と遠心分離の操作が必須である。しかし今後、洗浄・遠心分離操作が不要な、簡便なSonazoid-Lactadherin複合体の作製を目指すには、気泡溶液中のLactadherin濃度を正確に定量する測定系を確立する必要がある。そこで、Human MFG-E8 Quantikine ELISA Kit (DFGE80, R&D Systems)を用い、本研究で使用しているRecombinant Human MFG-E8 (Lactadherin, 2767-MF, R&D Systems)の測定および、Sonazoid-Lactadherin複合体中のLactadherin濃度について検討を行った。
結果と考察
新生血管に対する分子標的性の検討
Day7の担癌モデルマウスにおいて、Sonazoid-Lactadherin複合体投与直後は良好な腫瘍の造影像が認められたが、造影剤投与10分後に再度撮像を行ったところ、腫瘍内の染影はほぼ消失しており、腫瘍内へのSonazoid-Lactadherin複合体の滞留がほとんど認められない事を示唆する結果であった。この原因としては、Sonazoidの気泡密度(気泡数)の経時的な低下が大きく関係していると推察され、これを克服するには生体へ投与する直前にSonazoid-Lactadherin複合体を調製する、新たな気泡作製法の開発が必要だと分かった。
簡便な分子標的気泡作製法の実現に向けたLactadherin定量法の確立
ELISAにてRecombinant Human MFG-E8の濃度を測定したところ、実際の濃度の1/40～1/20の値が算出されることが明らかとなった。また、Sonazoid-Lactadherin複合体溶液で検討したところ、5×105 bubbles/ mL～1×106 bubbles/mLに希釈することで、ELISAの測定レンジ内での定量が可能であることが明らかとなった。
Day7の担癌モデルマウスにおいて、Sonazoid-Lactadherin複合体投与直後は良好な腫瘍の造影像が認められたが、造影剤投与10分後に再度撮像を行ったところ、腫瘍内の染影はほぼ消失しており、腫瘍内へのSonazoid-Lactadherin複合体の滞留がほとんど認められない事を示唆する結果であった。この原因としては、Sonazoidの気泡密度(気泡数)の経時的な低下が大きく関係していると推察され、これを克服するには生体へ投与する直前にSonazoid-Lactadherin複合体を調製する、新たな気泡作製法の開発が必要だと分かった。
簡便な分子標的気泡作製法の実現に向けたLactadherin定量法の確立
ELISAにてRecombinant Human MFG-E8の濃度を測定したところ、実際の濃度の1/40～1/20の値が算出されることが明らかとなった。また、Sonazoid-Lactadherin複合体溶液で検討したところ、5×105 bubbles/ mL～1×106 bubbles/mLに希釈することで、ELISAの測定レンジ内での定量が可能であることが明らかとなった。
結論
本年度の検討から、Sonazoid-Lactadherin複合体を用いた超音波分子イメージングの実現に、洗浄・遠心分離操作が不要な気泡作製法の早急な開発が必要であることが明らかとなった。また一方で、その簡便な気泡作製法の開発に必要な、Sonazoid-Lactadherin複合体溶液中のLactadherin濃度の定量法を確立した。今後は、これまでに確立した様々な実験系を駆使して、Sonazoid-Lactadherin複合体を用いた新生血管及び新鮮血栓に対する超音波分子イメージングの開発を進めて行く予定である。
公開日・更新日
公開日
2015-06-17
更新日
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