文献情報
文献番号
199800411A
報告書区分
総括
研究課題名
ゲノムインプリンティングがかかわる疾患ならびにゲノム解析
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
向井 常博(佐賀医科大学)
研究分担者(所属機関)
- 佐々木裕之(国立遺伝学研究所)
- 陣野吉広(琉球大学医学部附属沖縄・アジア医学研究センター)
- 石野史敏(東京工業大学遺伝子実験施設)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 ヒトゲノム・遺伝子治療研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
45,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
ゲノムインプリンティングは非メンデル遺伝を示す現象として新しく発見された遺伝現象である。その破綻により、発育障害や過成長を来す疾患、神経病、糖尿病のほか、種々の腫瘍、また、未同定の疾患が発症する。これらの疾患は一部その責任遺伝子も特定されつつあるが、メカニズムを始めまだ未解明の部分がほとんどである。ここではゲノムインプリンティングが関与するヒト疾患に関する研究を行う。そのために1)ゲノム解析法を利用してインプリンティング領域のヒト 11P15.5 とそれに対応するマウスゲノムの解析を行い、Beckwith-Wiedemann 症候群の本態にせまると共に疾患モデル動物の作成を含む機能解析を行う。2)多因子病のインシュリン依存性糖尿病はインプリンティングを受けた遺伝子の関与が示唆されているが、その本態を明らかにする。3)インプリンティングにかかわる遺伝子は未同定のものが多いので班員により開発された体系的スクリーニング法を利用して全染色体領域を含めた新規遺伝子の単離を行い、それから疾患原因遺伝子との対応をつける。
研究方法
新規遺伝子の探索のために、11p15.5のヒトESTの探索を行い対応するマウスクローンを分離した。STSマーカーの配列をもとにマウスのYAC、BACラーブラリーをスクリーニングし、クローンを分離して整列化した。塩基配列の決定にはBACクローンを用い、ショットガン法で行った。RT-PCRにより単離されたIDDMK1,2-22に対応する核内遺伝子を単離し、該当遺伝子領域近傍の多型マーカーを同定した。マウスの Peg1/Mest 遺伝子のゲノム DNA 構造を決定し、遺伝指標的マウスの作成のために組換え体 DNA を作製し、ES細胞に導入した。ヒトSRS 患者の血液サンプルからゲノム DNAを分離し、血液におけるPEG1/MEST 遺伝子自身の欠損、または変異検索を検討した。
結果と考察
Beckwith-Biedemann 症候群に関連する領域の構造と機能解析の中で、先ず新規遺伝子の単離と解析を行った。ヒトTAPA1からNAP2 遺伝子に至る領域においてITM、SMS-1, SMS-2 遺伝子などを明らかにした。一方、マウス遺伝子では Itm, Sms-1 遺伝子などを明らかにした。ITM 遺伝子は インプリンティングを受けている。SMS-1遺伝子は 成人組織で調べた限りでは、インプリンティングを受けていない。一方、SMS-2 遺伝子はKVLQT1遺伝子内部にあり、KVLQT1 と転写方向が逆向きである。インプリンティングを受けており、父親由来遺伝子が発現している。次に胎児性腫瘍の解析を行った。この領域に互いに隣接して存在するIMPT1, IPL, ORCTL2S について、Wilms腫瘍、横紋筋肉腫、肝芽腫、副腎腫瘍における変異解析を施行した。その結果、Wilms腫瘍1例でミスセンス変異、副腎腫瘍1例と肝芽腫1例においてLOHを認めた。マウス 7F4/F5 インプリンティング領域の機能解析と疾患遺伝子の探索を行った。マウス第7染色体F4/F5領域およそ1MbをカバーするYAC、BAC、コスミドを単離・整列化し、その物理地図を完成した。得られたBACクローンを用いて、向井研究室(研究代表者)佐々木研究室(研究分担者)や榊研究室(東大医科研)と共同でショットガン法による全塩基配列の決定を開始した。哺乳類で知られていた唯一のDNAメチルトランスフェラーゼDnmt1の触媒部位のアミノ酸配列をもとに、BLASTを用いてESTデータベースを検索し、新たなDNAメチルトランスフェラーゼと思われるヒト、マウスのcDNAを同定した。インシュリン依存性糖尿病の一原因として内在性レトロウィルスIDDMK1,2-22の関わりを明らかにするために、クローンを得た。塩基配列との比較で99.
7%のホモロジーが得られた。しかし、env領域の塩基配列から翻訳されるスーパー抗原のアミノ酸配列は100%一致した。塩基配列解析の結果、このHERV遺伝子はCD48遺伝子の第一イントロン中にこれと逆向きに存在することが判明した。FISHによる染色体局在は1番染色体長腕 1q21.3-q22 に決定した。マウスPeg1/Mest遺伝子のノックアウトマウスを作成した。父親からPeg1/Mest遺伝子の欠損が伝わる場合、出生前後の成長遅延がすべてのマウスにおいて確認された。また、これらの中には新生児致死性を示すものもかなりの頻度で存在した。しかし、同じ変異が母親から伝わる場合には全くこれらの異常は観察されなかった。このことから、ここに見られた異常は、父性インプリンティング遺伝子Peg1/Mest の欠損の影響であることが結論された。これは、ヒトPEG1/MEST 遺伝子がゲノムインプリンティング型遺伝病であるSilver-Russell 症候群 (SRS) の最有力原因遺伝子であること、このPeg1/MestノックアウトマウスがSRSのモデルマウスとなりうることを示唆している。そこで、日本人の14家系の孤発性SRS患者におけるPEG1/MEST遺伝子の変異、欠損を調査した。患者のcDNAをダイレクトシーケンスを行ったが、これらの家系から欠損を含めPEG1/MEST遺伝子の変異を示す証拠はまだ得られていない。(考察)当該マウス領域の完全なクローン化と物理地図作成を終え、全塩基配列の決定が最終段階に入ったことで、疾患関連新規遺伝子や制御配列の探索を行う土台がほぼ完成した。RT-PCRによって単離されたIDDMK 1,2-22に対応する核内遺伝子を目指して単離されたHERV遺伝子はIDDMK1,2-22と99.7%の高いホモロジーを示した。このことは新しく単離した遺伝子がHERV-K18と同一のもので、配列の不一致は多型やシーケンシングエラーによる可能性を示唆する。この領域はイギリスの最新のIDDMの遺伝解析で、感受性遺伝子の存在する可能性のある領域として新たに同定された領域 1q12-q24 に含まれる。Peg1/Mestノックアウトマウスの示す表現型から、ヒトPEG1/MEST遺伝子がSRSの原因遺伝子の最有力候補であることが示された。しかし、SRS患者のゲノム解析からはこれまでのところ、遺伝子欠損、変異は発見されていない。この原因としては、遺伝学的解析から、SRSの原因遺伝子は複数(少なくとも5つ位)あることが考えられるため、PEG1/MEST遺伝子の異常により発症するケースは必ずしも多くないことが考えられる。遺伝子欠損、変異の検出には解析数を増やす必要があるのかも知れない。
7%のホモロジーが得られた。しかし、env領域の塩基配列から翻訳されるスーパー抗原のアミノ酸配列は100%一致した。塩基配列解析の結果、このHERV遺伝子はCD48遺伝子の第一イントロン中にこれと逆向きに存在することが判明した。FISHによる染色体局在は1番染色体長腕 1q21.3-q22 に決定した。マウスPeg1/Mest遺伝子のノックアウトマウスを作成した。父親からPeg1/Mest遺伝子の欠損が伝わる場合、出生前後の成長遅延がすべてのマウスにおいて確認された。また、これらの中には新生児致死性を示すものもかなりの頻度で存在した。しかし、同じ変異が母親から伝わる場合には全くこれらの異常は観察されなかった。このことから、ここに見られた異常は、父性インプリンティング遺伝子Peg1/Mest の欠損の影響であることが結論された。これは、ヒトPEG1/MEST 遺伝子がゲノムインプリンティング型遺伝病であるSilver-Russell 症候群 (SRS) の最有力原因遺伝子であること、このPeg1/MestノックアウトマウスがSRSのモデルマウスとなりうることを示唆している。そこで、日本人の14家系の孤発性SRS患者におけるPEG1/MEST遺伝子の変異、欠損を調査した。患者のcDNAをダイレクトシーケンスを行ったが、これらの家系から欠損を含めPEG1/MEST遺伝子の変異を示す証拠はまだ得られていない。(考察)当該マウス領域の完全なクローン化と物理地図作成を終え、全塩基配列の決定が最終段階に入ったことで、疾患関連新規遺伝子や制御配列の探索を行う土台がほぼ完成した。RT-PCRによって単離されたIDDMK 1,2-22に対応する核内遺伝子を目指して単離されたHERV遺伝子はIDDMK1,2-22と99.7%の高いホモロジーを示した。このことは新しく単離した遺伝子がHERV-K18と同一のもので、配列の不一致は多型やシーケンシングエラーによる可能性を示唆する。この領域はイギリスの最新のIDDMの遺伝解析で、感受性遺伝子の存在する可能性のある領域として新たに同定された領域 1q12-q24 に含まれる。Peg1/Mestノックアウトマウスの示す表現型から、ヒトPEG1/MEST遺伝子がSRSの原因遺伝子の最有力候補であることが示された。しかし、SRS患者のゲノム解析からはこれまでのところ、遺伝子欠損、変異は発見されていない。この原因としては、遺伝学的解析から、SRSの原因遺伝子は複数(少なくとも5つ位)あることが考えられるため、PEG1/MEST遺伝子の異常により発症するケースは必ずしも多くないことが考えられる。遺伝子欠損、変異の検出には解析数を増やす必要があるのかも知れない。
結論
Beckwith-Wiedemann 症候群の原因遺伝子をさらに探するために新規遺伝子の探索を行った結果、いくつかの遺伝子を同定し、インプリンティングの有無を明らかにした。さらに、この疾患ならびにインプリンティングの機構を塩基配列レベルで理解するために、ヒト11p15.5 に対応するマウス7F4/F5 領域のインプリンティング領域を完全にクローン化し、得られたBACクローンを用いてシークエンスを開始した。父性発現インプリンティング遺伝子Peg1/Mest は、マウスを用いた分子生物学的解析からヒトSilver-Russell 症候群 (SRS) の原因遺伝子の最有力候補であることが示された。ヒトのSRSの原因遺伝子の証明のために変異検索を続けている。また、インスリン依存性糖尿病 (IDDM) 患者膵臓培養上清よりRT-PCRで単離されたIDDMK1,2-22に対応すると考えられる核内遺伝子を単離した。
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