食品添加物等における遺伝毒性・発がん性の短期包括的試験法の開発に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201426012A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 食品添加物等における遺伝毒性・発がん性の短期包括的試験法の開発に関する研究
• 課題番号: H24-食品-一般-012
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 西川 秋佳(国立医薬品食品衛生研究所 安全性生物試験研究センター)

研究分担者(所属機関)

• 梅村　隆志(国立医薬品食品衛生研究所　病理部 )
• 小川久美子(国立医薬品食品衛生研究所　病理部 )

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 【補助金】 食品の安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究費: 12,100,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

発がん性試験は長期間を要する。近年開発されたレポーター遺伝子導入動物による遺伝毒性検索モデルは、臓器・組織レベルでの検索を可能にし、中でもgpt deltaは点突然変異及び欠失変異を効率よく検出できる。本研究はgpt deltaラットを用いて、肝臓ないしは腎臓を主たる標的とする発がん性・遺伝毒性物質の短期検出モデルの開発を目的とする。本試験法は発がん性・遺伝毒性を迅速に検出できる利点に加えて、遺伝毒性の検索に部分的肝切除や片側腎摘出によって採取した組織を有効利用することが特色の一つである。また、香料物質2-メチルフラン（2-MF）および基本骨格フランについて、gpt deltaラットを用いた中期包括試験法により、一般毒性、遺伝毒性ならびに発がん性を検討した。

研究方法

肝短期包括的試験法開発のため、雄gpt deltaラットに遺伝毒性肝発がん物質estragole （ES）、遺伝毒性非肝発がん物質aristolochic acid （AA）、非遺伝毒性肝発がん物質β-naphthoflavone（BNF）およびbarbital（BT）を4週間経口投与し、2週間の休薬後にdiethylnitrosamine（DEN）を腹腔内投与した。DEN投与の18時間前に部分肝切除を施し、切除肝よりDNAを抽出してgpt assayを実施した。DEN投与1週間後に被験物質の投与を再開し、試験開始13週間後に動物を解剖した。肝組織の一部をホルマリン固定し、免疫組織化学的にGST-PおよびPCNAを染色した。残りの組織を遺伝子解析用に液体窒素で凍結した。
腎短期包括的試験法開発のため、雌gpt deltaラットに遺伝毒性腎発がん物質aristolochic acid（AA）、雄ラット特有腎発がん物質d-limonene（DL）、非遺伝毒性腎発がん物質potassium dibasic phosphate（PDP）およびphenylbutazone（PBZ）を4週間経口投与した。その後、投薬を中断して試験開始6週間後にDENを腹腔内投与した。DEN投与の48時間前に片側腎摘出を実施し、摘出腎よりDNAを抽出してgpt assayを実施した。DEN投与1週間後に被験物質の投与を再開し、試験開始19週間後に動物を解剖した。病理組織学的に、atypical tubuleおよびatypical hyperplasiaを尿細管前腫瘍性病変とした。
2-MFの包括的評価のため、雄gpt deltaラットにフランを4週間経口投与した。肝臓を採取して、in vivo小核試験、レポーター遺伝子変異原性試験（gpt 及びSpi-アッセイ）、病理組織学的検索ならびにGST-P陽性細胞巣の定量解析を行った。

結果と考察

肝短期包括的試験法では、ES群およびAA群においてgpt変異体頻度が有意に増加し、ES群においてA:T-C:G transversionおよびA:T-G:C transition、AA群においてはA:T-T:A transversion変異頻度が有意に増加した。ES群におけるGST-P陽性細胞巣の数および面積、BNF群およびBT群におけるGST-P陽性細胞巣の数が有意に増加した。ES群ではPCNA陽性細胞率が有意に増加した一方で、AA群においては対照群との差はみられなかった。
腎短期包括的試験法では、AA群においてgpt変異体頻度およびA:T-T:A transversion変異頻度が有意に増加した。AA群およびPDP群における前腫瘍性病変の発生頻度および1個体あたりの発生個数、PBZ群における1個体あたりの発生個数が有意に増加した。
2-MFの4週間反復投与試験における病理組織学的検査の結果、肝細胞のアポトーシス、被膜化の細胞浸潤、卵円形細胞の増殖、さらには胆管線維症が認められた。一方、フラン投与に起因したGST-P陽性細胞巣および変異体頻度の変動は認められなかった。肝細胞を用いたin vivo小核試験において、小核を有する肝細胞の比率に変化はなかった。

結論

gpt deltaラットを用いた肝臓および腎臓を標的とする遺伝毒性・発がん性の短期包括的試験法を開発するため、既知発がん物質を含む種々の化学物質を改良プロトコールにより試験した結果、その有用性が証明された。
2-MFは基本骨格フランと同様な肝毒性を示し、肝発がん性が示唆されたが、フラン同様に肝臓におけるレポーター遺伝子変異原性は陰性であり、フラン骨格化合物によるラット肝発がん過程において、遺伝毒性メカニズムが関与している可能性は低いと考えられた。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-07-30
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201426012B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 食品添加物等における遺伝毒性・発がん性の短期包括的試験法の開発に関する研究
• 課題番号: H24-食品-一般-012
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 西川 秋佳(国立医薬品食品衛生研究所 安全性生物試験研究センター)

研究分担者(所属機関)

• 梅村　隆志(国立医薬品食品衛生研究所　病理部)
• 小川久美子(国立医薬品食品衛生研究所　病理部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 【補助金】 食品の安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

発がん性試験は長期間を要する。近年開発されたレポーター遺伝子導入動物による遺伝毒性検索モデルは、臓器・組織レベルでの検索を可能にし、中でもgpt deltaは点突然変異及び欠失変異を効率よく検出できる。本研究はgpt deltaラットを用いて、肝臓ないしは腎臓を主たる標的とする発がん性・遺伝毒性物質の短期検出モデルの開発を目的とする。本試験法は発がん性・遺伝毒性を迅速に検出できる利点に加えて、遺伝毒性の検索に部分的肝切除や片側腎摘出によって採取した組織を有効利用することが特色の一つである。また、香料物質2-メチルフラン（2-MF）および基本骨格フランについて、gpt deltaラットを用いた中期包括試験法により、一般毒性、遺伝毒性ならびに発がん性を検討した。

研究方法

肝短期包括的試験法開発のため、雄gpt deltaラットに遺伝毒性肝発がん物質estragole （ES）、遺伝毒性非肝発がん物質aristolochic acid （AA）、非遺伝毒性肝発がん物質β-naphthoflavone（BNF）およびbarbital（BT）を4週間経口投与し、2週間の休薬後にdiethylnitrosamine（DEN）を腹腔内投与した。DEN投与の18時間前に部分肝切除を施し、切除肝よりDNAを抽出してgpt assayを実施した。DEN投与1週間後に被験物質の投与を再開し、試験開始13週間後に動物を解剖した。肝組織の一部をホルマリン固定し、免疫組織化学的にGST-PおよびPCNAを染色した。残りの組織を遺伝子解析用に液体窒素で凍結した。
腎短期包括的試験法開発のため、雌gpt deltaラットに遺伝毒性腎発がん物質aristolochic acid（AA）、雄ラット特有腎発がん物質d-limonene（DL）、非遺伝毒性腎発がん物質potassium dibasic phosphate（PDP）およびphenylbutazone（PBZ）を4週間経口投与した。その後、投薬を中断して試験開始6週間後にDENを腹腔内投与した。DEN投与の48時間前に片側腎摘出を実施し、摘出腎よりDNAを抽出してgpt assayを実施した。DEN投与1週間後に被験物質の投与を再開し、試験開始19週間後に動物を解剖した。病理組織学的に、atypical tubuleおよびatypical hyperplasiaを尿細管前腫瘍性病変とした。
2-MFの包括的評価のため、雄gpt deltaラットにフランを4週間経口投与した。肝臓を採取して、in vivo小核試験、レポーター遺伝子変異原性試験（gpt 及びSpi-アッセイ）、病理組織学的検索ならびにGST-P陽性細胞巣の定量解析を行った。

結果と考察

肝短期包括的試験法では、ES群およびAA群においてgpt変異体頻度が有意に増加し、ES群においてA:T-C:G transversionおよびA:T-G:C transition、AA群においてはA:T-T:A transversion変異頻度が有意に増加した。ES群におけるGST-P陽性細胞巣の数および面積、BNF群およびBT群におけるGST-P陽性細胞巣の数が有意に増加した。ES群ではPCNA陽性細胞率が有意に増加した一方で、AA群においては対照群との差はみられなかった。
腎短期包括的試験法では、AA群においてgpt変異体頻度およびA:T-T:A transversion変異頻度が有意に増加した。AA群およびPDP群における前腫瘍性病変の発生頻度および1個体あたりの発生個数、PBZ群における1個体あたりの発生個数が有意に増加した。
2-MFの4週間反復投与試験における病理組織学的検査の結果、肝細胞のアポトーシス、被膜化の細胞浸潤、卵円形細胞の増殖、さらには胆管線維症が認められた。一方、フラン投与に起因したGST-P陽性細胞巣および変異体頻度の変動は認められなかった。肝細胞を用いたin vivo小核試験において、小核を有する肝細胞の比率に変化はなかった。

結論

gpt deltaラットを用いた肝臓および腎臓を標的とする遺伝毒性・発がん性の短期包括的試験法を開発するため、既知発がん物質を含む種々の化学物質を改良プロトコールにより試験した結果、その有用性が証明された。
2-MFは基本骨格フランと同様な肝毒性を示し、肝発がん性が示唆されたが、フラン同様に肝臓におけるレポーター遺伝子変異原性は陰性であり、フラン骨格化合物によるラット肝発がん過程において、遺伝毒性メカニズムが関与している可能性は低いと考えられた。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-07-30
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201426012C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: gpt deltaラットを用いた肝臓および腎臓を標的とする遺伝毒性・発がん性の短期包括的試験法を開発するため、既知発がん物質を含む種々の化学物質を改良プロトコールにより試験した結果、その有用性が証明された。; 2-MFは基本骨格フランと同様な肝毒性を示し、肝発がん性が示唆されたが、フラン同様に肝臓におけるレポーター遺伝子変異原性は陰性であり、フラン骨格化合物によるラット肝発がん過程において、遺伝毒性メカニズムが関与している可能性は低いと考えられた。
• 臨床的観点からの成果: 特になし。
• ガイドライン等の開発: 特になし。
• その他行政的観点からの成果: 特になし。
• その他のインパクト: 特になし。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 15件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 4件
• 学会発表(国際学会等): 1件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Akagi J, Toyoda T, Cho YM, et al.; Validation study of the combined repeated-dose toxicity and genotoxicity assay using gpt delta rats.; Cancer Science , 106 (5) , 529-541 (2015); 10.1111/cas.12634
• 原著論文2: Matsushita K, Ishii Y, Takasu S, et al.; A medium-term gpt delta rat model as an in vivo system for analysis of renal carcinogenesis and the underlying mode of action.; Exp Toxicol Pathol. , 67 (1) , 31-39 (2015); 10.1016/j.etp.2014.09.006
• 原著論文3: Ishii Y, Matsushita K, Kuroda K, et al.; Acrylamide induces specific DNA adduct formation and gene mutations in a carcinogenic target site, the mouse lung.; Mutagenesis , 30 (2) , 227-235 (2015); 10.1093/mutage/geu062
• 原著論文4: Matsushita K, Kuroda K, Ishii Y, et al.; Improvement and validation of a medium-term gpt delta rat model for predicting chemical carcinogenicity and underlying mode of action.; Exp Toxicol Pathol. , 66 (7) , 313-321 (2014); 10.1016/j.etp.2014.05.002
• 原著論文5: Onami S, Cho YM, Toyoda T, et al.; Absence of in vivo genotoxicity of 3-monochloropropane-1,2-diol and associated fatty acid esters in a 4-week comprehensive toxicity study using F344 gpt delta rats.; Mutagenesis , 29 (4) , 295-302 (2014); 10.1093/mutage/geu018
• 原著論文6: Tasaki M, Kuroiwa Y, Inoue T, et al.; Lack of nrf2 results in progression of proliferative lesions to neoplasms induced by long-term exposure to non-genotoxic hepatocarcinogens involving oxidative stress.; Exp Toxicol Pathol. , 66 (1) , 19-26 (2014); 10.1016/j.etp.2013.07.003
• 原著論文7: Hibi D, Kijima A, Kuroda K, et al.; Molecular mechanisms underlying ochratoxin A-induced genotoxicity: global gene expression analysis suggests induction of DNA double-strand breaks and cell cycle progression.; J Toxicol Sci. , 38 (1) , 57-69 (2013)
• 原著論文8: Hibi D, Kijima A, Suzuki Y, et al.; Effects of p53 knockout on ochratoxin A-induced genotoxicity in p53-deficient gpt delta mice.; Toxicology , 304 , 92-99 (2013); 10.1016/j.tox.2012.12.005
• 原著論文9: Jin M, Kijima A, Hibi D, et al.; In vivo genotoxicity of methyleugenol in gpt delta transgenic rats following medium-term exposure.; Toxicol Sci. , 131 (2) , 387-394 (2013); 10.1093/toxsci/kfs294
• 原著論文10: Tasaki M, Kuroiwa Y, Inoue T, et al.; Oxidative DNA damage and in vivo mutagenicity caused by reactive oxygen species generated in the livers of p53-proficient or -deficient gpt delta mice treated with non-genotoxic hepatocarcinogens.; J Appl Toxicol. , 33 (12) , 1433-1441 (2012)
• 原著論文11: Matsushita K, Kijima A, Ishii Y, et al.; Development of a Medium-term Animal Model Using gpt Delta Rats to Evaluate Chemical Carcinogenicity and Genotoxicity.; J Toxicol Pathol. , 26 (1) , 19-27 (2013); 10.1293/tox.26.19
• 原著論文12: Suzuki Y, Umemura T, Ishii Y, et al.; Possible involvement of sulfotransferase 1A1 in estragole-induced DNA modification and carcinogenesis in the livers of female mice.; Mutat Res. , 749 (1-2) , 23-28 (2012); 10.1016/j.mrgentox.2012.07.002
• 原著論文13: Jin M, Kijima A, Suzuki Y, et al.; n vivo genotoxicity of 1-methylnaphthalene from comprehensive toxicity studies with B6C3F1 gpt delta mice.; J Toxicol Sci. , 37 (4) , 711-721 (2012)
• 原著論文14: Suzuki Y, Umemura T, Hibi D, et al.; Possible involvement of genotoxic mechanisms in estragole-induced hepatocarcinogenesis in rats.; Arch Toxicol. , 86 (10) , 1593-1601 (2012); 10.1007/s00204-012-0865-8
• 原著論文15: Ishii Y, Inoue K, Takasu S, et al.; Determination of lucidin-specific DNA adducts by liquid chromatography with tandem mass spectrometry in the livers and kidneys of rats given lucidin-3-O-primeveroside.; Chem Res Toxicol. , 25 (5) , 1112-1118 (2012); 10.1021/tx300084p

公開日・更新日

• 公開日: 2018-06-18
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201426012Z