文献情報
文献番号
199800407A
報告書区分
総括
研究課題名
ゲノム情報を基盤とした疾病関連遺伝子の解明
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
関谷 剛男(国立がんセンター研究所)
研究分担者(所属機関)
- 大木操(国立がんセンター研究所)
- 横田淳(国立がんセンター研究所)
- 牛島俊和(国立がんセンター研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 ヒトゲノム・遺伝子治療研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
90,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
遺伝子異常を原因とするヒト疾患の理解、その診断、治 療、予防に資する情報を得ることは、現時点における健康科学の緊急かつ最重要の課題である。ヒトゲノム解析の進行に伴い、各染色体の物理的地図上に、疾病の原因ならびに関連遺伝子が次々と位置づけられている。しかし、これら既知遺伝子の数はまだまだ限られ、種々の技術で検出されるゲノム上の異常部位に疾病原因遺伝子候補を見いだすことは、まだまだ難しい状況にあり、さらに多くの疾患関連遺伝子の同定、マッピングが必要である。本研究は新規疾病関連遺伝子の同定を二つの方向から行い、ゲノム情報の充実を図ることにより、DNAの異常に起因する遺伝性疾患やがんの理解に資することを目的とする。第一は、新規にゲノム異常を検出した染色体領域について、物理的地図の情報を基盤に、該当する疾病関連遺伝子の単離、同定を行い、遺伝子地図に加えることである。第二は、疾患の原因となるDNAのメチル化の異常を示す遺伝子の同定である。CpGアイランドのメチル化は、遺伝子の発現抑制につながる。がん等の疾病においてそのメチル化、脱メチル化によって発現異常がもたらされる遺伝子の同定、また、疾病 関連遺伝子候補であるインプリンティング遺伝子の同定を行う。これらのDNA解析にあた っては、既存技術に加え、独自に開発したDNA解析技術等を駆使し、また、必要に応じて既存法の原理とは異なる発想による新技術の開発を行う。
研究方法
ゲノム異常検出技術で明らかにされた染色体領域における疾病関連遺伝子の同定、また、ゲノム上メチル化の異常が検出された領域に存在する遺伝子の単離、同定を行うことにより、疾病関連遺伝子に関するゲノム情報の充実を図る。下記の計画を分担、実施した。(1)第11染色体長腕のNotI制限酵素地図を基盤に、11q23領域の疾病関連遺伝子の同定に焦点を合わせ、肺がん、乳がんにおける染色体欠失領域をLOH解析での限界まで狭めた。このLOH解析によるがん抑制遺伝子追跡の限界を克服するために、ヒト肺がん細胞株へ該当領域に由来する長大DNA断片を導入し、その細胞の持つ造腫瘍性を抑制する生物学的機能を指標として、染色体11q23領域に想定されヒト肺がんに関与するがん抑制遺伝子の同定を行う。(2)第11染色体q23領域における染色体転座関連遺伝子の単離、同定のため、YAC、P1、コスミドクローンの解析でより詳細な物理的地図を作成する。(3)AP-PCR解析、LOH解析で検出している肺がんにおける第2、9、11、21染色体におけるヘテロ、ホモ欠失領域の遺伝子探索を行い、また、AP-PCRフィンガープリンティング解析で検出した種々のがんにおける異常DNA断片をプローブとして、ラジエーションハイブリッド解析を行うことにより、疾病関連遺伝子を同定するとともに、遺伝子地図の充実を図る。(4)胃粘膜細胞の分化異常と考えられる腸上皮化生におけるDNAメチル化異常をヒト胃手術材料に関し、MS-RDA法を用いて検索する。(5)高度にメチル化されたDNA断片をメチル化DNA結合MBDカラムクロマトグラフィーで分画して、ライブラリーを作成し、SPM法を用いてCpGアイランドに由来するDNA断片を含むクローンを検出することにより、インプリンティングによるメチル化遺伝子や、がんで特異的にメチル化されている遺伝子を網羅的に単離する。
結果と考察
(1)ヒト肺非小細胞がんのがん抑制遺伝子の存在が考えられる染色体11q23領域に関し、この領域を含む一連のYACクローンを、ヌードマウスに腫瘍を作るヒト肺がん細胞株へ導入し、このがん細胞株の造腫瘍性を抑制する活性を1個のクローンが持つことを明らか
にした。Alu配列を利用した相同組み換えを酵母細胞内で行い、DNAを断片化する工夫で、該当遺伝子の存在領域を700キロ塩基対に絞り込んだ。さらに、このDNA断片の一部130キロ塩基対を含むPACクローンが抑制能を示し、がん抑制遺伝子を含んでいることが示唆され、全塩基配列を決定した。ヘテロ接合性の消失(LOH)は、がん抑制遺伝子の存在を示唆するが、LOH解析だけで欠失領域を狭めて、該当遺伝子の単離にまで到達することは不可能である。この限界を乗り越える一手段として、がん抑制遺伝子に期待される、がん細胞のヌードマウスにおける造腫瘍性を抑制する活性を指標とすることが、有効であることが示めされたと考える。(2)第11染色体q23.1の10メガ塩基対領域について、YAC、P1、PACクローンコンティグを単離し、より詳細な物理的地図を作製した。(3) AP-PCRフィンガープリント法で検出した異常DNA断片をプローブとした、ラジエーションハイブリッド解析により、肺がんにおける10q24-q25領域の欠失、縦隔繊維肉腫におけるMDM2遺伝子の増幅、さらには、神経膠芽腫において今までに報告のないサイクリンD3遺伝子の増幅を見いだした。また、肺がんにおける第2、9、18、21染色体上のホモ欠失領域を明らかにし、2q33、21q11領域からがん抑制遺伝子候補を単離した。AP-PCRフィンガープリント法で、ゲノム上の無作為位置から増幅したDNA断片における異常の検出は、ラジエーションハイブリッド解析と組み合わせることにより、標的となる遺伝子を設定することなしに、既知あるいは未知遺伝子における異常を簡便に明らかにすることができる。しかし、現時点では、ヒトゲノム上で明らかにされている遺伝子の数がまだまだ少ないため、異常DNA断片の染色体上の存在位置を同定しても、直ちに該当遺伝子にたどり着くことは難しい。ゲノム上の遺伝子配列決定の進行に応じて、また、将来、全配列が決定された場合には、たちどころに異常遺伝子を言い当てることが可能なアプローチと考える。(4)胃がんとの関連が考えられる腸上皮化生において、低メチル化状態にあるDNAクローン1個の単離に成功した。(5)CpGアイランドに由来するDNA断片は、GCに富む塩基配列を持つことから、変性剤濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、部分変性した分子を与える。この分子は極端に小さい移動度を示し、長時間泳動した後、ゲル中に残存する。この性質を利用したCpGアイランド単離法SPMを開発している。一方、高度にメチル化されたDNA断片をメチル化DNA結合ドメイン(MBD)カラムクロマトグラフィーで分画する技術を新たに確立した。肺がん手術材料から得られたDNA断片をMBDカラムクロマトグラフィーで分画し、得られた高度にメチル化されたDNA断片をラムダベクターにつないでライブラリーを作成し、SPM法を用いてCpGアイランドに由来するDNA断片を持つクローンを選択した。このライブラリーに含まれる3 x 105個のクローンのうち1 x 103個のクローンを解析した段階で、9個のCpGアイランドを同定した。そのうちの8個は、正常細胞においてもメチル化され、インプリンティング遺伝子の可能性が考えられた。残る1個のCpGアイランドは、肺がんで特異的にメチル化されていた。高度にメチル化されたDNA断片で作成したライブラリーには、3ゲノム相当のクローンが含まれていると計算された。したがって、ライブラリーに含まれるクローン3 x 105個の1/300を解析した段階での結果から、肺がん組織には、ゲノムあたり900個のメチル化CpGが存在し、このうちの100個ががん細胞で特異的にメチル化されるCpGアイランドと算定できる。これらのCpGアイランド断片の単離同定は、比較的短期間で達成できると考えている。対応する遺伝子の同定で、インプリント遺伝子やDNAメチル化で不活性化するがん抑制遺伝子を網羅的に把握することが可能と考える。
にした。Alu配列を利用した相同組み換えを酵母細胞内で行い、DNAを断片化する工夫で、該当遺伝子の存在領域を700キロ塩基対に絞り込んだ。さらに、このDNA断片の一部130キロ塩基対を含むPACクローンが抑制能を示し、がん抑制遺伝子を含んでいることが示唆され、全塩基配列を決定した。ヘテロ接合性の消失(LOH)は、がん抑制遺伝子の存在を示唆するが、LOH解析だけで欠失領域を狭めて、該当遺伝子の単離にまで到達することは不可能である。この限界を乗り越える一手段として、がん抑制遺伝子に期待される、がん細胞のヌードマウスにおける造腫瘍性を抑制する活性を指標とすることが、有効であることが示めされたと考える。(2)第11染色体q23.1の10メガ塩基対領域について、YAC、P1、PACクローンコンティグを単離し、より詳細な物理的地図を作製した。(3) AP-PCRフィンガープリント法で検出した異常DNA断片をプローブとした、ラジエーションハイブリッド解析により、肺がんにおける10q24-q25領域の欠失、縦隔繊維肉腫におけるMDM2遺伝子の増幅、さらには、神経膠芽腫において今までに報告のないサイクリンD3遺伝子の増幅を見いだした。また、肺がんにおける第2、9、18、21染色体上のホモ欠失領域を明らかにし、2q33、21q11領域からがん抑制遺伝子候補を単離した。AP-PCRフィンガープリント法で、ゲノム上の無作為位置から増幅したDNA断片における異常の検出は、ラジエーションハイブリッド解析と組み合わせることにより、標的となる遺伝子を設定することなしに、既知あるいは未知遺伝子における異常を簡便に明らかにすることができる。しかし、現時点では、ヒトゲノム上で明らかにされている遺伝子の数がまだまだ少ないため、異常DNA断片の染色体上の存在位置を同定しても、直ちに該当遺伝子にたどり着くことは難しい。ゲノム上の遺伝子配列決定の進行に応じて、また、将来、全配列が決定された場合には、たちどころに異常遺伝子を言い当てることが可能なアプローチと考える。(4)胃がんとの関連が考えられる腸上皮化生において、低メチル化状態にあるDNAクローン1個の単離に成功した。(5)CpGアイランドに由来するDNA断片は、GCに富む塩基配列を持つことから、変性剤濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、部分変性した分子を与える。この分子は極端に小さい移動度を示し、長時間泳動した後、ゲル中に残存する。この性質を利用したCpGアイランド単離法SPMを開発している。一方、高度にメチル化されたDNA断片をメチル化DNA結合ドメイン(MBD)カラムクロマトグラフィーで分画する技術を新たに確立した。肺がん手術材料から得られたDNA断片をMBDカラムクロマトグラフィーで分画し、得られた高度にメチル化されたDNA断片をラムダベクターにつないでライブラリーを作成し、SPM法を用いてCpGアイランドに由来するDNA断片を持つクローンを選択した。このライブラリーに含まれる3 x 105個のクローンのうち1 x 103個のクローンを解析した段階で、9個のCpGアイランドを同定した。そのうちの8個は、正常細胞においてもメチル化され、インプリンティング遺伝子の可能性が考えられた。残る1個のCpGアイランドは、肺がんで特異的にメチル化されていた。高度にメチル化されたDNA断片で作成したライブラリーには、3ゲノム相当のクローンが含まれていると計算された。したがって、ライブラリーに含まれるクローン3 x 105個の1/300を解析した段階での結果から、肺がん組織には、ゲノムあたり900個のメチル化CpGが存在し、このうちの100個ががん細胞で特異的にメチル化されるCpGアイランドと算定できる。これらのCpGアイランド断片の単離同定は、比較的短期間で達成できると考えている。対応する遺伝子の同定で、インプリント遺伝子やDNAメチル化で不活性化するがん抑制遺伝子を網羅的に把握することが可能と考える。
結論
AP-PCR法やLOH解析によって検出された染色体上の異常箇所、特に欠失領域における該当遺伝子の追求には、異常領域をできるだけ狭めることが必要である。しかし、これらの解析だけでは、この領域を遺伝子単離にまで狭めることは不可能である。こ
のゲノム解析における限界を克服する手段として、該当遺伝子に期待される生物機能を指標とする解析が極めて有効であった。既存技術の解析限界を乗り越える工夫による、新たな遺伝子の単離は、遺伝子地図における情報の充実につながるものである。ヒト疾病におけるエピジェネティックなDNA異常の実体は、まだ明らかではない。この異常には、CpGアイランドのメチル化、あるいは、脱メチル化による遺伝子発現の異常の寄与が大きいと考えられている。メチル化DNA断片を分画するMBDカラムクロマトグラフィーとCpGアイランドに由来するDNA断片を単離するSPM法を組み合わせたアプローチは、高度にメチル化されているCpGアイランドを網羅的に単離し、該当する遺伝子を明らかにすることを可能にする。DNAメチル化異常の疾病への関与の理解に役立つと考えられた。
のゲノム解析における限界を克服する手段として、該当遺伝子に期待される生物機能を指標とする解析が極めて有効であった。既存技術の解析限界を乗り越える工夫による、新たな遺伝子の単離は、遺伝子地図における情報の充実につながるものである。ヒト疾病におけるエピジェネティックなDNA異常の実体は、まだ明らかではない。この異常には、CpGアイランドのメチル化、あるいは、脱メチル化による遺伝子発現の異常の寄与が大きいと考えられている。メチル化DNA断片を分画するMBDカラムクロマトグラフィーとCpGアイランドに由来するDNA断片を単離するSPM法を組み合わせたアプローチは、高度にメチル化されているCpGアイランドを網羅的に単離し、該当する遺伝子を明らかにすることを可能にする。DNAメチル化異常の疾病への関与の理解に役立つと考えられた。
公開日・更新日
公開日
-
更新日
-