文献情報
文献番号
199800406A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒト難聴、がん関連遺伝子の単離のための動物ゲノム解析
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
木南 凌(新潟大学医学部)
研究分担者(所属機関)
- 木南凌(新潟大学医学部)
- 中釜斉(国立がんセンター研究所発がん研究部)
- 米川博通(東京都臨床医学総合研究所実験動物研究部門)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 ヒトゲノム・遺伝子治療研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
50,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
疾患原因遺伝子の解析による病態の解明や診断法の開発は現在ヒトゲノム解析に負うところが大きい。しかし、モデル動物を用いた解析系も同時に重要である。本研究では単一因子性の聴覚障害を示すjs、sh-2変異、および複数因子が関与するがんを対象に、動物ゲノム解析法により原因遺伝子の探索を行う。(1)劣性突然変異js、sh-2マウスはヒトの非症候群性の常染色体劣性難聴(DNFB)のモデルである。現在まで、報告されている22種類のDFNBの内単離された遺伝子は僅かに5種類である。約2,000人に1人の頻度で出現するヒト聴覚障害新生児は難聴と共に深刻な言語障害を伴う。出生後早期の遺伝子診断が可能になれば、聴覚障害を持つ可能性のある新生児を対象に重点的な発音訓練を施すことにより、言語障害を軽減化することが可能となるはずである。(2)発がん関連遺伝子を探索したヒトゲノム解析は多大な貢献をもたらしてきたが、解析対象家系が現在限界に近づきつつある。そこで、今後は動物モデル系の利用が重要と考えられる。本研究ではリンパ腫、大腸がんを対象にマウス、ラットのゲノム解析を行う。
研究方法
①js、sh-2候補遺伝子およびがん抑制遺伝子候補の検索:エクソントラッピング法、cDNA選択法、SPM法(DDGE法の1種)、およびヒト配列との保存領域の選択法を用いた。エクソン判定にはGRAILプログラム、データベースを利用した相同性検索法を採用した。②cDNAの単離にはライブラリーの選択法、PCR法によるエクソンの連結法、5'-RACE法を用いた。③放射線照射:放射線は生後4週齢から1週間間隔で2.5Gyずつ4回の分割照射を行った。④大腸癌感受性座のタイピング:戻し交配ラットにヘテロサイクリックアミン(PhIP)を400ppm投与し、異常腺窩(ACF)の誘発を観察した。遺伝子連鎖解析には、解析ソフトMapManager QTL ver 2.0 を用いた。
結果と考察
①sh-2候補遺伝子として新しいタイプのミオシン15型遺伝子が単離された。これでヒトのDFNB3の遺伝子診断の基礎が完成した。日本の遺伝性難聴の家系の組織化が待たれる。一方、jsの有力な候補遺伝子も単離された。それはキネシン様蛋白を指定する遺伝子(DAK)であった。完全長cDNAクローン単離のため、5'-、および3'-RACE法と内耳のcDNAライブラリーのスクリーニング法を行い、その結果現在までに約3.9kbの断片を単離し、塩基配列を決定した。DAK遺伝子全領域を含むBACのショットガンシーケンスを行い、7kbのプロモーター全領域と42kbのコーディング領域を明らかにした。発現パターンをIn situハイブリダイゼーション法を用いて観察すると、生後まもなく発現し、5日目に最も強い発現を示した。内耳の組織分化は生後5日目頃より盛んになることから、この遺伝子の発現パターンはその分化と非常によい一致を示した。キネシン様蛋白が聴覚という感覚器機能にも重要な役割を果たしているという発見は注目に値する。現在、DAKが原因遺伝子であることを確認するため、BACトランスジェネシスによる形質の回復実験を行っている。
②1)第11染色体上のIkaros候補遺伝子:リンパ腫発症に関与する3種類のがん抑制遺伝子座を見いだし、それが染色体D11Mit71座(セントロメア近傍)、染色体D12Mit279座(約0.45cM領域内)、D16Mit122座(約0.29cM領域内)にあることを報告してきた。今年度行った候補遺伝子の詳細な検索から、染色体11番、12番上に2つの候補遺伝子を見いだすことができた。第11染色体上のLOHのピーク領域にIkaros遺伝子がすでにマップされていた。この遺伝子は細胞核で働く転写因子でリンパ系細胞の分化、成熟に関与することが知られている。ホモ欠損マウスはリンパ球が造られず、重篤な免疫不全となる。一方、ヘテロ欠損マウスは異常なTリンパ球を産出し、それらの細胞は生後3ヶ月頃になって悪性腫瘍へと変化する。従って、Ikarosががん抑制遺伝子である可能性は極めて高い。Ikaros遺伝子のホモ欠損領域の検索、変異の同定により、Ikaros遺伝子がやはり原因遺伝子候補であることが分かった。今後、ヒトのT細胞白血病でIkarosが一つのがん抑制遺伝子として働いているかどうかを検討する。
2)第12染色体上の未知の候補遺伝子:BACクローンによる物理地図の作成を行った結果、TLSR12a領域を完全に含むBACによる連結クローンの単離が完了した。LOH解析を詳細に行い、その結果をこの物理地図上に投影させると、LOHのピークはほぼ35kbという極めて狭い領域に収まることが分かった。この領域の塩基配列の決定、この領域を含むBACクローンのランダム配列決定により、1つの有力候補遺伝子(DNA結合ドメインをもつ)が検索された。この候補遺伝子に変異が見られるかどうかを現在アッセイ中である。
3)D16Mit122近傍の共通アレル消失領域の物理地図作成をYAC、BACクローンの単離することにより行った。両者による物理地図は完成したが、BAC単独での連結クローンについては未だに完成に至っていない。これを現在急いでいる。
③ラット大腸がん感受性/抵抗性遺伝子座の同定:加熱肉食品中の発がん物質PhIPをラットに投与することにより誘発されるaberrant crypt foci(ACFs)の数を量的形質として、感受性遺伝子の連鎖解析を行った。BUFラットは高感受性(ラット一匹当たり平均12.2個のACF)、ACIは抵抗性(0.9 ACF/ rat)、F344は中等度の感受性(3.4 ACF / rat)を示し、系統間で感受性に差が認められた。そこで、(F344 x ACI) F1 x ACI戻し交配ラット170頭を対象にした連鎖解析を行った。その結果、F344型感受性遺伝子の候補染色体座はラット染色体16番D16Rat40とD16Rat40の間約8cMの範囲(Lod値4.2)にマップすることができた。今後はポジッショナルクローニングに向けて遺伝子の局在性を1-2cMにまで狭めて行く必要がある。この目的達成のために本領域に存在する多型マーカーを数多く単離する。同時に、コンジェニックラットおよびその組み換えラットを作製し、感受性テストを行って行く予定である。一方、BUFラットの劣性感受性遺伝子座の検討では、その存在が染色体6、9、11にあることが分かった。今後、さらに詳細に大腸発がん抵抗性遺伝子のマッピングを進めて行く方針である。
②1)第11染色体上のIkaros候補遺伝子:リンパ腫発症に関与する3種類のがん抑制遺伝子座を見いだし、それが染色体D11Mit71座(セントロメア近傍)、染色体D12Mit279座(約0.45cM領域内)、D16Mit122座(約0.29cM領域内)にあることを報告してきた。今年度行った候補遺伝子の詳細な検索から、染色体11番、12番上に2つの候補遺伝子を見いだすことができた。第11染色体上のLOHのピーク領域にIkaros遺伝子がすでにマップされていた。この遺伝子は細胞核で働く転写因子でリンパ系細胞の分化、成熟に関与することが知られている。ホモ欠損マウスはリンパ球が造られず、重篤な免疫不全となる。一方、ヘテロ欠損マウスは異常なTリンパ球を産出し、それらの細胞は生後3ヶ月頃になって悪性腫瘍へと変化する。従って、Ikarosががん抑制遺伝子である可能性は極めて高い。Ikaros遺伝子のホモ欠損領域の検索、変異の同定により、Ikaros遺伝子がやはり原因遺伝子候補であることが分かった。今後、ヒトのT細胞白血病でIkarosが一つのがん抑制遺伝子として働いているかどうかを検討する。
2)第12染色体上の未知の候補遺伝子:BACクローンによる物理地図の作成を行った結果、TLSR12a領域を完全に含むBACによる連結クローンの単離が完了した。LOH解析を詳細に行い、その結果をこの物理地図上に投影させると、LOHのピークはほぼ35kbという極めて狭い領域に収まることが分かった。この領域の塩基配列の決定、この領域を含むBACクローンのランダム配列決定により、1つの有力候補遺伝子(DNA結合ドメインをもつ)が検索された。この候補遺伝子に変異が見られるかどうかを現在アッセイ中である。
3)D16Mit122近傍の共通アレル消失領域の物理地図作成をYAC、BACクローンの単離することにより行った。両者による物理地図は完成したが、BAC単独での連結クローンについては未だに完成に至っていない。これを現在急いでいる。
③ラット大腸がん感受性/抵抗性遺伝子座の同定:加熱肉食品中の発がん物質PhIPをラットに投与することにより誘発されるaberrant crypt foci(ACFs)の数を量的形質として、感受性遺伝子の連鎖解析を行った。BUFラットは高感受性(ラット一匹当たり平均12.2個のACF)、ACIは抵抗性(0.9 ACF/ rat)、F344は中等度の感受性(3.4 ACF / rat)を示し、系統間で感受性に差が認められた。そこで、(F344 x ACI) F1 x ACI戻し交配ラット170頭を対象にした連鎖解析を行った。その結果、F344型感受性遺伝子の候補染色体座はラット染色体16番D16Rat40とD16Rat40の間約8cMの範囲(Lod値4.2)にマップすることができた。今後はポジッショナルクローニングに向けて遺伝子の局在性を1-2cMにまで狭めて行く必要がある。この目的達成のために本領域に存在する多型マーカーを数多く単離する。同時に、コンジェニックラットおよびその組み換えラットを作製し、感受性テストを行って行く予定である。一方、BUFラットの劣性感受性遺伝子座の検討では、その存在が染色体6、9、11にあることが分かった。今後、さらに詳細に大腸発がん抵抗性遺伝子のマッピングを進めて行く方針である。
結論
①js聴覚障害変異領域をカバーするBACクローンを検索し、新しいキネシン様遺伝子を単離した。BACトランスゲネシスにより形質の回復実験を行っている。②リンパ腫発症に関与する2種類のがん抑制遺伝子候補が単離された。一つは第11染色体上の既知の遺伝子・Ikarosであり、ホモ欠損、変異が同定された。もう一つは第12染色体上の新規の遺伝子である。③ラット大腸がん感受性遺伝子座を染色体16番D16Rat40とD16Rat40の間約8cMの範囲に特定した。
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