文献情報
文献番号
199800401A
報告書区分
総括
研究課題名
遺伝性小児がんの責任遺伝子の解明と小児のがんにおける遺伝的背景の解明 に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
水谷 修紀(国立小児医療研究センター)
研究分担者(所属機関)
- 中畑龍俊(東大医科学研究所)
- 秦順一(慶應義塾大学医部)
- 恒松由紀子(国立小児病院)
- 石岡千加史(東北大学加齢医学研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 ヒトゲノム・遺伝子治療研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
平成12(2000)年度
研究費
30,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
遺伝性腫瘍に関する分子生物学的研究を進め、散発性腫瘍の原因としてのこれらの遺伝子の役割を明らかにする。このような視点から1)Ataxia telangiectasiaおよびそのキャリアー由来細胞の細胞生物学的特性の解明と遺伝子異常の簡易診断法の確立、2)Fanconi貧血原因遺伝子の遺伝子診断法の確立、3)胎児性腫瘍の発生機構の解明。4)小児腫瘍において特にその材料を用いて遺伝的要因を解明することの社会、倫理的諸問題について解析を行う。
研究方法
患者より採血したヘパリン加末梢血から単核球を分離し、EBウイルスにより株化した。細胞周期はベクトンデッキンソン社FACScanによりLysis IIプログラムを用いて解析した。細胞への放射線量は基本的には5 Grayとした。アポトーシス細胞の算定は20mg/mlのPIにより染色し、FACScanによりsubdiploid 分画を算定した。
ATM cDNAの翻訳領域全長を6個のDNA断片に分割してアッセイするためのRT-PCR条件を設定した。これら6断片をSC assay用ベクターpCI-HA(URA3)-2のURA3 cDNAの5ユ側に翻訳フレームを一致させて挿入したプラスミドを構築した。
奇形を伴わない散発性Wilms腫瘍のWT1全exonの塩基配列決定を行った。散発性肝芽腫8例の腫瘍および非腫瘍組織についてNorthern解析でimprinting geneであるH19,IGF2 の発現を比較検討した.また,H19のプロモーター領域のメチル化をSouthern解析,bisulfite法によるシークエンスによって決定した。
FAC遺伝子各exon-intron boundariesにprimerを設定し、PCR-SSCP法で検出された変異バンドの塩基配列を確認した。また、FAA蛋白に対するポリクロナル抗体を作成し、FAA蛋白の発現をWestern blotおよびFACSにて解析した。
国立小児病院のがん患者とその家族に郵送自記式調査を行い、がん登録、保存材料の利用に関する意識調査とくに患者材料を遺伝的背景の検査に用いることを調査した。
ATM cDNAの翻訳領域全長を6個のDNA断片に分割してアッセイするためのRT-PCR条件を設定した。これら6断片をSC assay用ベクターpCI-HA(URA3)-2のURA3 cDNAの5ユ側に翻訳フレームを一致させて挿入したプラスミドを構築した。
奇形を伴わない散発性Wilms腫瘍のWT1全exonの塩基配列決定を行った。散発性肝芽腫8例の腫瘍および非腫瘍組織についてNorthern解析でimprinting geneであるH19,IGF2 の発現を比較検討した.また,H19のプロモーター領域のメチル化をSouthern解析,bisulfite法によるシークエンスによって決定した。
FAC遺伝子各exon-intron boundariesにprimerを設定し、PCR-SSCP法で検出された変異バンドの塩基配列を確認した。また、FAA蛋白に対するポリクロナル抗体を作成し、FAA蛋白の発現をWestern blotおよびFACSにて解析した。
国立小児病院のがん患者とその家族に郵送自記式調査を行い、がん登録、保存材料の利用に関する意識調査とくに患者材料を遺伝的背景の検査に用いることを調査した。
結果と考察
ATM遺伝子はcDNAの大きさとして10Kb以上の大きなものであり、その遺伝子異常をスクリーニングすることは容易ではない。しかし、少なくとも現時点までに明らかにされた異常は塩基の欠損を伴い、truncation type の異常であり、たんぱくの欠損を伴っているとされている。現在までに集めることのできたAT家系は10家系である。まず我々はこれらのB細胞株でATM蛋白発現のレベルを解析した。その結果すべてのAT株化細胞においてATM蛋白の発現が認められないことが判明した。またATキャリアー細胞におけるAT蛋白の発現量は正常の1/2から1/3であることが判明した。これらの細胞株を用いて放射線照射によるp21の転写効率、細胞周期のG0/G1アレスト誘導能について解析した。その結果AT細胞株でG0/G1アレスト誘導能に欠陥が認められた。細胞周期制御異常をさらに詳細に解析する目的で、Mitotic/Spindleチェックポイントの制御についても解析を加えた。その結果放射線照射96、144時間の時点でAT細胞に顕著な多倍体細胞の出現を認めた。一方放射線照射による細胞死の誘導能については全ての変異で等しく障害を認めた。
ATM遺伝子異常のスクリーニング法をさらに改善し、遺伝子異常を確定するスクリーニング法の開発は本研究の目的の一つである。このため、SC assay用ベクターpCI-HA(URA3)-2のURA3 cDNAの5ユ側に翻訳フレームを一致させて挿入したプラスミドをura3変異酵母株に導入・発現した。その結果、各ATM cDNA断片とURA3 cDNAの融合タンパク質を発現し、ウラシル欠損培地上で増殖能を獲得した(Ura+)。これらのベクターのATM配列内の制限酵素部位2ケ所を用いて切断・直線化することにより専用ギャップベクターを作成した。正常ATM細胞からRT-PCRにて増幅した各ATM断片と、各ATM断片に対応した専用ギャップベクターを酵母に導入するとDNA相同組み換えによりin vivoでATM-URA3融合タンパク質が発現した(Ura+)。一方、変異ATM細胞からRT-PCRにて増幅した各ATM断片の場合、ATM-URA3融合タンパク質が発現せず(Ura-)、正常ATM断片と区別できた。この方法を用いることによりATM遺伝子翻訳領域全長のナンセンスまたはフレームシフト変異を検出しうる可能性が示唆された。
胎児性腫瘍の表現形と遺伝子形の関連を明らかにする目的で、臨床的にDrash症候群と診断された症例から新たにWT1 遺伝子変異を見いだしたが、これらのうちintron9の変異例は7例であった.様式を詳細にした結果,+4(c→t)3例,+2(t→c)2例,+5(g→t),+5(g→a)各1例であった.これら全ての変異を含んだminigeneを作成し、cos細胞に遺伝子導入し、RT-PCRでその発現を解析した結果、これらの全ての変異でexon9のsplicing isoformのうち+KTS(lysine,threonine, serine)の発現が認められないことが明らかとなった.さらに,このような異常を認めた症例の病態を分析した結果,これらの症例はDrash症候群とは異った,Fraiser症候群(軽度の腎障害,性分化異常,Wilms腫瘍を欠く)に相当していることが明らかになった.散発性肝芽腫8例の腫瘍および非腫瘍組織についてNorthern解析でimprinting geneであるH19,IGF2 の発現を比較検討した.また,H19のプロモーター領域のメチル化をSouthern解析,bisulfite法によるシークエンスによって決定した.その結果,H19のmaternal LOHを3例,hypermethylationによるH19の不活性化(LOE)を4例認めた.
日本全土から集めたFA患者検体34例中9例に FACの変異を検出し、すべてがintron 4の同一の変異(IVS4+4 A to T)であった。この変異は欧米ではAshkenazi Jews に高率にみられる変異である。 IVS4変異群とnon-C群とで血液学的異常発症年齢(中央値; IVS4変異群4.99歳、non-C群5.8歳、P=0.534)、先天性奇形の重症度(平均値; IVS4変異群1.1、non-C群1.1 、P=0.981)は有意差を認めなかった。 non-C群由来の患者7名のうち、6名においてFAA蛋白発現の消失または異常を認めた。これらの症例はA群に属すると考えられた。
小児がん患者とその家族130人からアンケート調査への回答を得た。検査や手術で余った材料の保存、研究利用については、「自分(自分の子ども)に役立てばかまわない」95%、「がん研究のためならよい」95%であったが、同時に「これらを利用することを説明し同意をとるべき」が85%であった。通常の採血時に研究用に余分に採血することについても同程度の回答であった。保存材料を利用したがん遺伝研究については、「利用に際して説明し許可を得てほしい」が91%、「そうした研究に協力してもよい」71%であり、協力してもよい、もしくはわからないとした人のうち74%が「結果を知りたい」と答えた。院内がん登録については、「登録されていることをあらかじめ知らせてほしい」92%、「その後の情報を積極的に知らせてもよい」59%、「研究でわかった一般的情報を教えてほしい」92%であった。また、がん登録や保存材料利用をめぐる心配事については、「個人情報の医療者以外への漏洩」「研究のためにとらなくてもよい材料を余分にとられてしまうこと」などの回答が多かったが、情報が漏れて生命保険や受験、就職、いじめなどの差別にあうことについては、結婚に対する心配がやや多かったものの、いずれも全体の半数に及ばなかった。
ATM遺伝子異常のスクリーニング法をさらに改善し、遺伝子異常を確定するスクリーニング法の開発は本研究の目的の一つである。このため、SC assay用ベクターpCI-HA(URA3)-2のURA3 cDNAの5ユ側に翻訳フレームを一致させて挿入したプラスミドをura3変異酵母株に導入・発現した。その結果、各ATM cDNA断片とURA3 cDNAの融合タンパク質を発現し、ウラシル欠損培地上で増殖能を獲得した(Ura+)。これらのベクターのATM配列内の制限酵素部位2ケ所を用いて切断・直線化することにより専用ギャップベクターを作成した。正常ATM細胞からRT-PCRにて増幅した各ATM断片と、各ATM断片に対応した専用ギャップベクターを酵母に導入するとDNA相同組み換えによりin vivoでATM-URA3融合タンパク質が発現した(Ura+)。一方、変異ATM細胞からRT-PCRにて増幅した各ATM断片の場合、ATM-URA3融合タンパク質が発現せず(Ura-)、正常ATM断片と区別できた。この方法を用いることによりATM遺伝子翻訳領域全長のナンセンスまたはフレームシフト変異を検出しうる可能性が示唆された。
胎児性腫瘍の表現形と遺伝子形の関連を明らかにする目的で、臨床的にDrash症候群と診断された症例から新たにWT1 遺伝子変異を見いだしたが、これらのうちintron9の変異例は7例であった.様式を詳細にした結果,+4(c→t)3例,+2(t→c)2例,+5(g→t),+5(g→a)各1例であった.これら全ての変異を含んだminigeneを作成し、cos細胞に遺伝子導入し、RT-PCRでその発現を解析した結果、これらの全ての変異でexon9のsplicing isoformのうち+KTS(lysine,threonine, serine)の発現が認められないことが明らかとなった.さらに,このような異常を認めた症例の病態を分析した結果,これらの症例はDrash症候群とは異った,Fraiser症候群(軽度の腎障害,性分化異常,Wilms腫瘍を欠く)に相当していることが明らかになった.散発性肝芽腫8例の腫瘍および非腫瘍組織についてNorthern解析でimprinting geneであるH19,IGF2 の発現を比較検討した.また,H19のプロモーター領域のメチル化をSouthern解析,bisulfite法によるシークエンスによって決定した.その結果,H19のmaternal LOHを3例,hypermethylationによるH19の不活性化(LOE)を4例認めた.
日本全土から集めたFA患者検体34例中9例に FACの変異を検出し、すべてがintron 4の同一の変異(IVS4+4 A to T)であった。この変異は欧米ではAshkenazi Jews に高率にみられる変異である。 IVS4変異群とnon-C群とで血液学的異常発症年齢(中央値; IVS4変異群4.99歳、non-C群5.8歳、P=0.534)、先天性奇形の重症度(平均値; IVS4変異群1.1、non-C群1.1 、P=0.981)は有意差を認めなかった。 non-C群由来の患者7名のうち、6名においてFAA蛋白発現の消失または異常を認めた。これらの症例はA群に属すると考えられた。
小児がん患者とその家族130人からアンケート調査への回答を得た。検査や手術で余った材料の保存、研究利用については、「自分(自分の子ども)に役立てばかまわない」95%、「がん研究のためならよい」95%であったが、同時に「これらを利用することを説明し同意をとるべき」が85%であった。通常の採血時に研究用に余分に採血することについても同程度の回答であった。保存材料を利用したがん遺伝研究については、「利用に際して説明し許可を得てほしい」が91%、「そうした研究に協力してもよい」71%であり、協力してもよい、もしくはわからないとした人のうち74%が「結果を知りたい」と答えた。院内がん登録については、「登録されていることをあらかじめ知らせてほしい」92%、「その後の情報を積極的に知らせてもよい」59%、「研究でわかった一般的情報を教えてほしい」92%であった。また、がん登録や保存材料利用をめぐる心配事については、「個人情報の医療者以外への漏洩」「研究のためにとらなくてもよい材料を余分にとられてしまうこと」などの回答が多かったが、情報が漏れて生命保険や受験、就職、いじめなどの差別にあうことについては、結婚に対する心配がやや多かったものの、いずれも全体の半数に及ばなかった。
結論
細胞死や細胞周期制御機構の障害がATやそのキャリアーの正常体細胞で認められることを初めて明らかにした。出芽酵母を用いるSC assay によりATM遺伝子翻訳領域全長のナンセンスまたはフレームシフト変異を検出しうる診断系を開発した。WT1exon9-10の異常を同定は,Wilms腫瘍の発生と腎障害の病態を予測する遺伝子診断としても有用であることが明らかになった.今後,形態形成と腫瘍発生との関連を詳細にしたい。FA患者検体34例中9例に FACの変異を検出した。non-C群由来の患者7名のうち、6名はA群に属すると考えられた。がんの遺伝研究においては患者への協力を求めるには、詳細なインフォームド・コンセントと癌の遺伝研究についての社会の理解が必要である。
公開日・更新日
公開日
-
更新日
-