文献情報
文献番号
199800400A
報告書区分
総括
研究課題名
病理組織に発現する疾病関連遺伝子の包括的解析
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
広橋 説雄(国立がんセンター研究所)
研究分担者(所属機関)
- 野口雅之(筑波大学基礎医学系)
- 佐々木博己(国立がんセンター研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 ヒトゲノム・遺伝子治療研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
平成12(2000)年度
研究費
70,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
本研究は、疾病の原因となる或いは病態や予後を決定する疾病遺伝子を捉
え、遺伝子レベルでの診断に基づく治療法の選択を可能にするために、疾病遺伝子発
現データベースを蓄積することを目的とする。この目的を達成するために、組織切片
上のマイクロダイセクション法と発現遺伝子の包括的解析法の両者を改良し効率化す
る。これにより、疾病遺伝子発現データベースの蓄積を加速させ疾病遺伝子を同定す
ると同時に、病理診断を客観化し医療の質の向上に役立てることを目指す。
え、遺伝子レベルでの診断に基づく治療法の選択を可能にするために、疾病遺伝子発
現データベースを蓄積することを目的とする。この目的を達成するために、組織切片
上のマイクロダイセクション法と発現遺伝子の包括的解析法の両者を改良し効率化す
る。これにより、疾病遺伝子発現データベースの蓄積を加速させ疾病遺伝子を同定す
ると同時に、病理診断を客観化し医療の質の向上に役立てることを目指す。
研究方法
1.マイクロダイセクション法による病変細胞の分離:肺腺がんの臨床材料
の凍結切片を用いてHE染色を施行し、Laser microscope systems(PALM UV-laser
microbeam,Wolfratshausen,D-82515 Germany)でがん部とその間質部を分離採取し、
RNAを抽出した。real time quantitative RT-PCRを行い、mRNAの発現を定量的に評価
し、マイクロダイセクション法による組織の分離並びに採取の正確性について検討し
た。16例の肺がん切除後の再発胸水の細胞診材料から、マイクロマニピュレーターを
用いたマイクロダイセクションを行い、腫瘍細胞を1から40個採取し、DNAを抽出した
後、K-ras遺伝子、p53遺伝子の異常をPCR-SSCP法を用いて解析した。
2.肝がんの転移性により発現が異なる遺伝子群の同定:転移モデルにて転移、浸潤能
に差がある事が示されている2つの cell line (PLC/PRF/5, KYN-2) を用い、
Differential Display法にて両者で発現に差のある遺伝子について検討した。計216
通りの組み合わせでRT-PCRを施行した。finger print上、両cell line間で差の認め
られたbandは、H.A.Yellow添加アガロース更にH.A.Red添加アガロースでDNAを精製し
、Direct Sequenceを施行し塩基配列を決定した。臨床検体HCC14症例18病変(中ない
し高分化型12病変、低分化型6病変、転移性を示さない症例～高度に示す症例を含む
)の腫瘍部と非腫瘍部よりRNAを抽出しcDNAのパネルを作成した。各clone 毎に
specific primerを設定し、real time quantitative PCRで検討した。定量数値の比
較は、GAPDHで補正した値で行った。
3.肺がん・肝がんの発生、進展過程で発現が異なる遺伝子群の同定:外科手術切除材
料より、非癌部、癌部のそれぞれの組織切片を肉眼的に採取しtotal RNAを抽出した
。肺がんに於いては正常2例、非浸潤がん3例、浸潤がん2例、肝がんに於いては異な
る悪性度を示す3症例の各がん部及び非がん部を用いた。上述のDifferential
Display法を行い差の認められるバンドを抽出し、塩基配列を決定した。
4.cDNAチップ技術導入の基礎的検討:がん細胞において発現量の異なる80の遺伝子
のcDNAをポリ陽イオンコートスライドグラスに静電結合で固定化したミニチップを作
製した。さらにポリカルボジイミド樹脂をコートしたスライドグラスに共有結合する
方法も検討した。スキルス胃がん培養細胞株8株から精製したRNAからcDNAを合成し
、正常胃粘膜および非スキルス胃がん培養細胞株8株から合成したcDNAとのサブトラ
クションを行った。がん組織からの生きたがん細胞の分離法並びに質の良いRNAの分
離法を検討した。
の凍結切片を用いてHE染色を施行し、Laser microscope systems(PALM UV-laser
microbeam,Wolfratshausen,D-82515 Germany)でがん部とその間質部を分離採取し、
RNAを抽出した。real time quantitative RT-PCRを行い、mRNAの発現を定量的に評価
し、マイクロダイセクション法による組織の分離並びに採取の正確性について検討し
た。16例の肺がん切除後の再発胸水の細胞診材料から、マイクロマニピュレーターを
用いたマイクロダイセクションを行い、腫瘍細胞を1から40個採取し、DNAを抽出した
後、K-ras遺伝子、p53遺伝子の異常をPCR-SSCP法を用いて解析した。
2.肝がんの転移性により発現が異なる遺伝子群の同定:転移モデルにて転移、浸潤能
に差がある事が示されている2つの cell line (PLC/PRF/5, KYN-2) を用い、
Differential Display法にて両者で発現に差のある遺伝子について検討した。計216
通りの組み合わせでRT-PCRを施行した。finger print上、両cell line間で差の認め
られたbandは、H.A.Yellow添加アガロース更にH.A.Red添加アガロースでDNAを精製し
、Direct Sequenceを施行し塩基配列を決定した。臨床検体HCC14症例18病変(中ない
し高分化型12病変、低分化型6病変、転移性を示さない症例～高度に示す症例を含む
)の腫瘍部と非腫瘍部よりRNAを抽出しcDNAのパネルを作成した。各clone 毎に
specific primerを設定し、real time quantitative PCRで検討した。定量数値の比
較は、GAPDHで補正した値で行った。
3.肺がん・肝がんの発生、進展過程で発現が異なる遺伝子群の同定:外科手術切除材
料より、非癌部、癌部のそれぞれの組織切片を肉眼的に採取しtotal RNAを抽出した
。肺がんに於いては正常2例、非浸潤がん3例、浸潤がん2例、肝がんに於いては異な
る悪性度を示す3症例の各がん部及び非がん部を用いた。上述のDifferential
Display法を行い差の認められるバンドを抽出し、塩基配列を決定した。
4.cDNAチップ技術導入の基礎的検討:がん細胞において発現量の異なる80の遺伝子
のcDNAをポリ陽イオンコートスライドグラスに静電結合で固定化したミニチップを作
製した。さらにポリカルボジイミド樹脂をコートしたスライドグラスに共有結合する
方法も検討した。スキルス胃がん培養細胞株8株から精製したRNAからcDNAを合成し
、正常胃粘膜および非スキルス胃がん培養細胞株8株から合成したcDNAとのサブトラ
クションを行った。がん組織からの生きたがん細胞の分離法並びに質の良いRNAの分
離法を検討した。
結果と考察
1.マイクロダイセクション法による病変細胞の分離:Laser microscope
systemsを用いる事によりがん組織のがん部ならびに間質部から別々にmRNAを抽出す
ることが出来た。また、上皮性ならびに間葉系のマーカーを調べることで、がん部と
間質部が正確に分離採取されていることが確認された。1個の細胞を用いても1コピ
ーの遺伝子の異常(点突然変異)を解析できることが明らかとなった。特に細胞診材
料は組織切片のように薄切されていない、つまり観察している細胞すべての核酸が採
取できる点で優れた病理材料といえる。
2.肝がんの転移性により発現が異なる遺伝子群の同定:両cell line間で発現の異な
るbandのうち最終的に84 clone(PLC/PRF/5に優位に発現しているもの;34 clone,
KYN-2;50 clone)について塩基配列を決定した。臨床検体のパネルを用いた評価では
、腫瘍部で発現が高い5 clone、非腫瘍部で発現が高い7 cloneの計12 cloneで、腫瘍
部、非腫瘍部で明瞭な違いが認められ、その内訳は、既知;5 clone, EST ; 7 clone
であった。2 cloneでは腫瘍の転移性との対応も見られた。
3.肺がん・肝がんの発生、進展過程で発現が異なる遺伝子群の同定:肺がんに於いて
は、発現の異なるバンドのうち最終的に118 clone、肝がんに於いては86 cloneにつ
いて塩基配列を決定した。既知の遺伝子は、肺がん23 clone、肝がん33 clone、未知
ないしESTはそれぞれ95 clone, 22 cloneであった。
4.cDNAチップ技術導入の基礎的
検討:ポリカルボジイミド樹脂をコートしたグラスへの、cDNAの固定化率は90%以上
と高かった。高感度な検出が期待される。またこの方法はアルデヒド基導入スライド
グラスへの固定化のようにcDNAをアミノ化する必要がなく安価な検出法であるといえ
る。スキルス胃がんで特異的に発現する遺伝子の存在を調べるためサブトラクション
を終了した。がん組織から、RNAの抽出やFISH解析にも使える生きたがん細胞の分離
法をうることができた。凍結がん組織からの良質のRNAの抽出としては液体チッソで
冷やしたスチール製の容器中で敏速に粉砕する方法がもっとも有効である結果を得た
。
systemsを用いる事によりがん組織のがん部ならびに間質部から別々にmRNAを抽出す
ることが出来た。また、上皮性ならびに間葉系のマーカーを調べることで、がん部と
間質部が正確に分離採取されていることが確認された。1個の細胞を用いても1コピ
ーの遺伝子の異常(点突然変異)を解析できることが明らかとなった。特に細胞診材
料は組織切片のように薄切されていない、つまり観察している細胞すべての核酸が採
取できる点で優れた病理材料といえる。
2.肝がんの転移性により発現が異なる遺伝子群の同定:両cell line間で発現の異な
るbandのうち最終的に84 clone(PLC/PRF/5に優位に発現しているもの;34 clone,
KYN-2;50 clone)について塩基配列を決定した。臨床検体のパネルを用いた評価では
、腫瘍部で発現が高い5 clone、非腫瘍部で発現が高い7 cloneの計12 cloneで、腫瘍
部、非腫瘍部で明瞭な違いが認められ、その内訳は、既知;5 clone, EST ; 7 clone
であった。2 cloneでは腫瘍の転移性との対応も見られた。
3.肺がん・肝がんの発生、進展過程で発現が異なる遺伝子群の同定:肺がんに於いて
は、発現の異なるバンドのうち最終的に118 clone、肝がんに於いては86 cloneにつ
いて塩基配列を決定した。既知の遺伝子は、肺がん23 clone、肝がん33 clone、未知
ないしESTはそれぞれ95 clone, 22 cloneであった。
4.cDNAチップ技術導入の基礎的
検討:ポリカルボジイミド樹脂をコートしたグラスへの、cDNAの固定化率は90%以上
と高かった。高感度な検出が期待される。またこの方法はアルデヒド基導入スライド
グラスへの固定化のようにcDNAをアミノ化する必要がなく安価な検出法であるといえ
る。スキルス胃がんで特異的に発現する遺伝子の存在を調べるためサブトラクション
を終了した。がん組織から、RNAの抽出やFISH解析にも使える生きたがん細胞の分離
法をうることができた。凍結がん組織からの良質のRNAの抽出としては液体チッソで
冷やしたスチール製の容器中で敏速に粉砕する方法がもっとも有効である結果を得た
。
結論
本研究は、疾病の原因となる或いは病態や予後を決定する疾病遺伝子を捉え、
遺伝子レベルでの診断に基づく治療法の選択を可能にするために、疾病遺伝子発現デ
ータベースを蓄積することを目的とする。本年度は、マイクロダイセクション法によ
る病変細胞の分離、肝がんの転移性により発現が異なる遺伝子群の同定、肺がん・肝
がんの発生、進展過程で発現が異なる遺伝子群の同定、cDNAチップ技術導入の基礎的
検討などを行った。今後は、マイクロダイセクションされた微量RNAを対象に
Differential Display法を行い、発現に差のある遺伝子についてさらにin situハイ
ブリダイゼーションによる情報も加え、各症例の病理所見、臨床経過と対応させた疾
病遺伝子発現データベースを作成する。またチップとのハイブリダイゼーションの条
件と感度の検討などを行い、微量なRNAを用いたcDNAチップの技術を確立する。
遺伝子レベルでの診断に基づく治療法の選択を可能にするために、疾病遺伝子発現デ
ータベースを蓄積することを目的とする。本年度は、マイクロダイセクション法によ
る病変細胞の分離、肝がんの転移性により発現が異なる遺伝子群の同定、肺がん・肝
がんの発生、進展過程で発現が異なる遺伝子群の同定、cDNAチップ技術導入の基礎的
検討などを行った。今後は、マイクロダイセクションされた微量RNAを対象に
Differential Display法を行い、発現に差のある遺伝子についてさらにin situハイ
ブリダイゼーションによる情報も加え、各症例の病理所見、臨床経過と対応させた疾
病遺伝子発現データベースを作成する。またチップとのハイブリダイゼーションの条
件と感度の検討などを行い、微量なRNAを用いたcDNAチップの技術を確立する。
公開日・更新日
公開日
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