臨床応用をめざした造血器腫瘍原因遺伝子の単離と疾患モデルマウスの作成

文献情報

文献番号
199800392A
報告書区分
総括
研究課題名
臨床応用をめざした造血器腫瘍原因遺伝子の単離と疾患モデルマウスの作成
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
金倉　譲(大阪大学医学部バイオメデイカル教育センター)
研究分担者(所属機関)
  • 北村幸彦(大阪大学医学部、病理学講座)
  • 竹田潤二(大阪大学医学部、環境医学講座)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 ヒトゲノム・遺伝子治療研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
平成12(2000)年度
研究費
40,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
近年の分子生物学の進歩により造血器腫瘍の分野においても多くの癌遺伝子が単離されてきた。しかし、一部の例外的な疾患を除いて、実際の症例の多くにおいてどのような遺伝子異常が原因となり腫瘍化がおこるのかについては明らかではない。従来、造血器腫瘍における新規癌遺伝子のクローニングは、染色体転座部位の近傍に存在する遺伝子をポジショナルクローニングするという方法がとられてきた。また同様に癌抑制遺伝子のクローニングについても染色体欠失部位に存在する遺伝子を検索するという方法が用いられてきた。しかし、いずれの方法も、特定の染色体異常が検出された場合にのみ解析が可能で、染色体異常が検出できない症例や複雑すぎる染色体異常を有する症例は解析不可能であった。我々は、本研究プロジェックトにおいて、retrovirusを用いたfunctional cloning systemを用いて造血器腫瘍患者の腫瘍細胞から癌遺伝子を直接的にクローニングし、その機能についての解析を行うことを目的としている。
研究方法
我々は、本研究において造血細胞に対し極めて効率よく遺伝子導入を行うことが可能なretrovirusの感染システムを用いて個々の造血器腫瘍の患者腫瘍細胞よりその原因遺伝子をクローニングする計画である。具体的には、1. 造血器腫瘍細胞よりcDNAライブラリーを作成し、retrovirusの発現ベクターにsubcloningする。2. マウスのIL-3依存性細胞株Ba/F3にretrovirusの発現ライブラリーを感染させる。3. IL-3非依存下でも増殖可能なクローンを獲得する。4. 獲得したクローンのcDNAあるいはgenomic DNAをtemplateにしretrovirusのベクター部分をprimerとしてPCRを行い、組み込まれたcDNAを回収する。この方法により造血因子非依存性の増殖をもたらす腫瘍化遺伝子のクローニングを試みる計画である。更に、これらクローニングされた遺伝子を用いてトランスジェニックマウスやCre-loxP systemを用いたコンデイショナルなターゲテイングマウスを作成することにより、その分子のin vivoでの機能についても詳細に解析する計画である。
結果と考察
1. retrovirusの発現クローニングシステムについて。本年度は、基礎検討として種々のretrovirus、いくつかの造血因子依存性細胞株を用いてより効率の良い感染システムの確立を試みた。GFPの発現によってその感染効率を評価した結果、pMX由来のretrovirusをBa/F3細胞に感染させた場合、極めて高い感染効率(約95%)であることを確認した。現在、8例の患者の発現ライブラリーをこのretrovirusを用いてBa/F3細胞に感染させクローンを選択中である。2. 疾患モデルマウスの作成について。多くの遺伝子のノックアウトマウスは胎生致死であり、血液系だけで遺伝子を破壊するシステムを開発する必要性がある。分担研究者の武田らは、そのシステムを構築するためPNHのモデルマウスを作製した。まず、PNHの原因遺伝子であるPIG-AをloxP配列で挟みこんだマウスと、Creリコンビネースを胎生初期より発現しているマウスを交配した。そのマウスは致死だったので、胎仔より肝細胞を取り出し、致死量照射したレシピエントマウスに移入した。この手法により血液系だけで遺伝子破壊が起きたマウスを構築することに成功した。このシステムは、一般化することが可能であり、今後致死性が認められる遺伝子の機能解析に有効と考えられる。
結論
本年度は、3年計画の1年目であり、造血器腫瘍原因遺伝子の単離とその機能解析の基盤となる研究を行った。現在、造血器腫瘍患者より作成したcDNA発現ライブラリーをBa/F3細胞に感染させ
ており、造血因子非依存性に増殖するクローンを選択中である。また、Cre-loxPシステムを用いて血液系細胞特異的にコンデイショナルターゲッテイングマウスの作成が可能となった。今後、造血器腫瘍に特異的な遺伝子を単離しトランスジェニックマウスやコンデイショナルターゲッテイングマウスを作成する予定である。

公開日・更新日

公開日
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更新日
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