文献情報
文献番号
201419083A
報告書区分
総括
研究課題名
レット症候群の早期診断と治療をめざした統合的研究
課題番号
H24-神経・筋-一般-007
研究年度
平成26(2014)年度
研究代表者(所属機関)
伊藤 雅之(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター 神経研究所疾病研究第二部)
研究分担者(所属機関)
- 松石 豊次郎(久留米大学医学部小児科)
- 白川 哲夫(日本大学歯学部小児歯科)
- 高橋 悟(旭川医科大学医学部小児科)
- 青天目 信(大阪大学医学部小児科)
- 堀家 慎一(金沢大学)
- 田中 輝幸(東京大学大学院医学系研究科発達医科学)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 【補助金】 障害者対策総合研究
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成26(2014)年度
研究費
14,077,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
レット症候群は多彩な症状のため診断に苦慮する。有効な治療法がなく、早期からの療育が求められる。そこで、診断基準を改定し、診療ガイドブックを作成して、早期診断の推進をはかる。レット症候群の原因遺伝子としてMECP2が同定されて以来、類似した臨床症状を呈する非典型例の存在が知られ、それらの原因遺伝子の機能喪失および重複による臨床像の特徴を明らかにする。基礎研究では、MeCP2欠損マウス（Mecp2-/y）をはじめとしたモデル動物や細胞を用いて、様々な病態の解明と治療法開発の基盤的研究を展開する。
研究方法
2010年の診断基準の基づき、本邦に適合した改正、注釈を加えて、新しい診断基準を公表した。また、各分野の専門医、研究者へ執筆依頼し、診療ガイドブックを作成した。
遺伝子解析は、末梢白血球DNAを用いて、塩基配列決定法にて行った。動物実験では、①生後2週齢のMecp2-/yと野生型の延髄腹側呼吸核群からDNAを抽出し、bisulfite処理を行ったのちGad1プロモーター領域の塩基配列を決定し、23ヶ所のCpGのメチル化cytosineを検出した。さらに、脳組織を固定後二重染色を行った。②IGFBP3遺伝子改変マウスを作成し、Mecp2-/yとの二重改変マウスを作成した。これらマウスの行動学的、形態学的解析とIGF-1発現を調べた。③Cdkl5 欠損マウスでは、神経細胞の微小形態、薬物投与による易けいれん性解析、等を行った。④Mecp2-/y のES細胞の心筋分化マーカー遺伝子や蛋白質の発現、および電子顕微鏡による心臓の刺激伝道系を検討し、心筋分化能、形態異常を評価した。また、Mecp2-/yの心エコーによる心機能と心電図の計測を行った。Mecp2-/yの心臓の遺伝子発現は、30個の心臓特異的遺伝子の定量PCRにより解析した。細胞実験では、ヒト染色体工学技術を用いてPWS-ICを欠失させた改変ヒト15番染色体を構築し、qRT-PCR、 DNAメチル化解析、DNA-FISH法、ChIP法により、15q11-q13領域のクロマチン動態と遺伝子発現を調べた。
（倫理面への配慮等）すべての研究は、各研究施設の当該倫理委員会の承認を得て、臨床研究においては患者あるいは保護者への十分な説明と同意を得てのちに行った。また、組み換えDNA実験安全委員会、実験動物倫理問題等検討委員会等の承認を得たのちに行った。各研究は、当該研究施設の利益相反に関する審査、承認を得たのちに行った。
遺伝子解析は、末梢白血球DNAを用いて、塩基配列決定法にて行った。動物実験では、①生後2週齢のMecp2-/yと野生型の延髄腹側呼吸核群からDNAを抽出し、bisulfite処理を行ったのちGad1プロモーター領域の塩基配列を決定し、23ヶ所のCpGのメチル化cytosineを検出した。さらに、脳組織を固定後二重染色を行った。②IGFBP3遺伝子改変マウスを作成し、Mecp2-/yとの二重改変マウスを作成した。これらマウスの行動学的、形態学的解析とIGF-1発現を調べた。③Cdkl5 欠損マウスでは、神経細胞の微小形態、薬物投与による易けいれん性解析、等を行った。④Mecp2-/y のES細胞の心筋分化マーカー遺伝子や蛋白質の発現、および電子顕微鏡による心臓の刺激伝道系を検討し、心筋分化能、形態異常を評価した。また、Mecp2-/yの心エコーによる心機能と心電図の計測を行った。Mecp2-/yの心臓の遺伝子発現は、30個の心臓特異的遺伝子の定量PCRにより解析した。細胞実験では、ヒト染色体工学技術を用いてPWS-ICを欠失させた改変ヒト15番染色体を構築し、qRT-PCR、 DNAメチル化解析、DNA-FISH法、ChIP法により、15q11-q13領域のクロマチン動態と遺伝子発現を調べた。
（倫理面への配慮等）すべての研究は、各研究施設の当該倫理委員会の承認を得て、臨床研究においては患者あるいは保護者への十分な説明と同意を得てのちに行った。また、組み換えDNA実験安全委員会、実験動物倫理問題等検討委員会等の承認を得たのちに行った。各研究は、当該研究施設の利益相反に関する審査、承認を得たのちに行った。
結果と考察
改正診断基準を公表した。今後、これによる診断と遺伝子診断の相関を調べる。また、診療ガイドブックを刊行した。このガイドブックを利用することによる疾患認知と早期診断の関係を患者データベース登録システムを利用して追跡する。
動物実験では、①延髄腹側呼吸核群のGad1プロモーター領域のCpGメチル化レベルに母親由来のアレルの違いが影響していることがわかった。Mecp2-/yの無呼吸はこれらの高メチル化とそれによるGad1 mRNAの転写抑制、GAD1発現低下によるGABA合成の減少が推測された。②IGFBP3欠損マウス、IGFBP3過剰発現マウス、Mecp2-/yとの二重改変マウスの行動学的、形態学的解析とIGF-1発現はいずれもIGFBP3欠損によって回復することが分かった。IGFBP3の量的異常が発症病態に影響していることから、IGFBP3が治療のターゲットになりうると考えられる。③Cdkl5欠損マウスでは、海馬CA1錐体神経細胞の易けいれん誘発性がみられ、グルタミン酸障害がわかった。④Mecp2-/y のES細胞の心筋分化過程で、特異的な遺伝子発現がが認められた。Mecp2-/yの心臓の生理学的解析では、QT延長と左心室壁の菲薄化があった。心筋分化にMeCP2が寄与している可能性が示唆された。細胞実験では、父方特異的なMAGEL2遺伝子の発現低下が認められ、15ｑ11-ｑ13領域にPWS-ICを欠失したが父方アレル特異的クロマチン脱凝集は維持されていた。一方、PWS-IC欠失母方染色体では異所的にクロマチン脱凝集が起こっていた。正常母方アレルにおけるコンパクトなクロマチン状態の維持に重要であると考えられた。
動物実験では、①延髄腹側呼吸核群のGad1プロモーター領域のCpGメチル化レベルに母親由来のアレルの違いが影響していることがわかった。Mecp2-/yの無呼吸はこれらの高メチル化とそれによるGad1 mRNAの転写抑制、GAD1発現低下によるGABA合成の減少が推測された。②IGFBP3欠損マウス、IGFBP3過剰発現マウス、Mecp2-/yとの二重改変マウスの行動学的、形態学的解析とIGF-1発現はいずれもIGFBP3欠損によって回復することが分かった。IGFBP3の量的異常が発症病態に影響していることから、IGFBP3が治療のターゲットになりうると考えられる。③Cdkl5欠損マウスでは、海馬CA1錐体神経細胞の易けいれん誘発性がみられ、グルタミン酸障害がわかった。④Mecp2-/y のES細胞の心筋分化過程で、特異的な遺伝子発現がが認められた。Mecp2-/yの心臓の生理学的解析では、QT延長と左心室壁の菲薄化があった。心筋分化にMeCP2が寄与している可能性が示唆された。細胞実験では、父方特異的なMAGEL2遺伝子の発現低下が認められ、15ｑ11-ｑ13領域にPWS-ICを欠失したが父方アレル特異的クロマチン脱凝集は維持されていた。一方、PWS-IC欠失母方染色体では異所的にクロマチン脱凝集が起こっていた。正常母方アレルにおけるコンパクトなクロマチン状態の維持に重要であると考えられた。
結論
本邦の実情に合わせたわかりやすいレット症候群の診断基準に改正した。また、診療ガイドブックを作成した。これらを活用することで、レット症候群の早期診断が可能となることが期待される。
基礎研究では、多角的なアプローチにより、治療法開発の礎となる成果を得ることができた。今後、これらの成果を発展させ、臨床応用へ展開させる。
基礎研究では、多角的なアプローチにより、治療法開発の礎となる成果を得ることができた。今後、これらの成果を発展させ、臨床応用へ展開させる。
公開日・更新日
公開日
2015-05-29
更新日
-