文献情報
文献番号
199800368A
報告書区分
総括
研究課題名
うつ病の発症機序と治癒機転の分子生物学的研究
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
樋口 輝彦(昭和大学藤が丘病院精神神経科学教室)
研究分担者(所属機関)
- 上島国利(昭和大学医学部精神医学教室)
- 小口勝司(昭和大学医学部第一薬理学教室)
- 木内祐二(昭和大学薬学部病態生理学教室)
- 山脇成人(広島大学医学部神経精神医学教室)
- 森信繁(滋賀医科大学医学部精神医学教室)
- 小澤寛樹(札幌医科大学医学部神経精神医学教室)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 脳科学研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
-
研究費
32,500,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
有病率が4%にものぼり社会生活上長期に亘り多大な影響を与えるうつ病の発
症機序と治癒機転の研究は緊急かつ必要性の高い課題である。従来より動物を用いた抗う
つ薬や電撃ショックの作用機転の検討に基づき、うつ病態と抗うつ作用の解明が試みられ
てきたが、現在でもその基盤となる神経化学的変化は明らかでなく、また国内では患者脳
から得られた情報も少ない。抗うつ薬は連投で始めて効果が得られるため、その抗うつ作
用には何らかの機能蛋白の発現を介した可塑的変化の関与が指摘されている。また、抗う
つ薬は従来より知られるモノアミントランスポーターに加え、モノアミン受容体以降のア
デニル酸シクラーゼ、イノシト-ル3リン酸、細胞内カルシウム動態やプロテインキナー
ゼなどの細胞内情報伝達系に作用する可能性も指摘され、その作用機序解明にはこれらの
蛋白やその発現調節系を対象とした分子レベルの研究が望まれる。一方、抗うつ薬の標的
分子として上述のような既知蛋白質のみの変化を想定して研究を進めることの危険性も指
摘され、抗うつ薬投与後の未知遺伝子の発現量の変化もスクリーニングできるDifferenti
al Display法(RNA-fingerprinting法)を用いた検討も望まれる。うつ病の発症機序とそ
の治癒機転に関わる分子メカニズムを明らかにするためには上記のような総合的なアプロ
ーチが求められており、われわれは報告の少ない患者脳での検討も含め複数のin vitroお
よびin vivo実験系を用いて初年度に引き続き検討を行った。
症機序と治癒機転の研究は緊急かつ必要性の高い課題である。従来より動物を用いた抗う
つ薬や電撃ショックの作用機転の検討に基づき、うつ病態と抗うつ作用の解明が試みられ
てきたが、現在でもその基盤となる神経化学的変化は明らかでなく、また国内では患者脳
から得られた情報も少ない。抗うつ薬は連投で始めて効果が得られるため、その抗うつ作
用には何らかの機能蛋白の発現を介した可塑的変化の関与が指摘されている。また、抗う
つ薬は従来より知られるモノアミントランスポーターに加え、モノアミン受容体以降のア
デニル酸シクラーゼ、イノシト-ル3リン酸、細胞内カルシウム動態やプロテインキナー
ゼなどの細胞内情報伝達系に作用する可能性も指摘され、その作用機序解明にはこれらの
蛋白やその発現調節系を対象とした分子レベルの研究が望まれる。一方、抗うつ薬の標的
分子として上述のような既知蛋白質のみの変化を想定して研究を進めることの危険性も指
摘され、抗うつ薬投与後の未知遺伝子の発現量の変化もスクリーニングできるDifferenti
al Display法(RNA-fingerprinting法)を用いた検討も望まれる。うつ病の発症機序とそ
の治癒機転に関わる分子メカニズムを明らかにするためには上記のような総合的なアプロ
ーチが求められており、われわれは報告の少ない患者脳での検討も含め複数のin vitroお
よびin vivo実験系を用いて初年度に引き続き検討を行った。
研究方法
(1)ラットにイミプラミンあるいはサートラリン 5 および10 mg/日を21日
間腹腔内投与後、脳内各部位を摘出した。得られたcDNAを全90通りのプライマーの組み合
わせでPCRを行い、電気泳動後、RNA fingerprintingを検出した。薬物処置群で特異的に
増加しているPCR産物の塩基配列を決定し、既知の遺伝子の塩基配列と比較検討した。さ
らに、Northern Blot法等で遺伝子発現増加、Western Blot法で蛋白量増加の確認を行っ
た。未知遺伝子の場合はRACE法で全塩基配列を決定した。(2)急性拘束ストレス後ある
いはパロキセチン急性投与後の大脳皮質前頭部、海馬のリン酸化CREBの変化はimmunoblot
ing法で検討した。急性あるいは慢性拘束ストレス後、急性あるいは慢性抗うつ薬(デシ
プラミン、Org4428)投与後の同部位のカルシニューリンのmRNA発現量はNorthern Blot
法とin situ hybridization法で検討した。(3)PC12細胞を抗うつ薬を含む各種精神作
用薬存在下で1、2または5日間培養した。培養終了後、細胞を十分洗浄した後、50 nM
[3H]NAを加え37℃で10分間インキュベーションして取り込みを行った。(4)C6細胞に熱
ストレス処置し、あるいはリチウムを添加して培養し、セロトニンまたはトロンビン刺激
性の細胞内Ca2+濃度上昇(fura-2蛍光強度)を検討した。また、上記に対するheat shock
protein (HSP) 合成阻害薬クエルセチン、プロテアーゼ阻害薬DEVD、セリンプロテア-
ゼのプラスミンの効果も検討した。(5)単極性うつ病患者および対照患者死後脳の前頭
葉皮質から調整した膜標本でアデニル酸シクラーゼ (AC) 活性、セロトニン刺激性ホスフ
ォリパーゼC (PLC) 活性、I 型AC、PLCb、総CREB、リン酸化CREB蛋白量を検討した。大う
つ病患者および対照患者から得た血小板のセロトニン刺激性細胞内Ca2+濃度変化も検討し
た。
間腹腔内投与後、脳内各部位を摘出した。得られたcDNAを全90通りのプライマーの組み合
わせでPCRを行い、電気泳動後、RNA fingerprintingを検出した。薬物処置群で特異的に
増加しているPCR産物の塩基配列を決定し、既知の遺伝子の塩基配列と比較検討した。さ
らに、Northern Blot法等で遺伝子発現増加、Western Blot法で蛋白量増加の確認を行っ
た。未知遺伝子の場合はRACE法で全塩基配列を決定した。(2)急性拘束ストレス後ある
いはパロキセチン急性投与後の大脳皮質前頭部、海馬のリン酸化CREBの変化はimmunoblot
ing法で検討した。急性あるいは慢性拘束ストレス後、急性あるいは慢性抗うつ薬(デシ
プラミン、Org4428)投与後の同部位のカルシニューリンのmRNA発現量はNorthern Blot
法とin situ hybridization法で検討した。(3)PC12細胞を抗うつ薬を含む各種精神作
用薬存在下で1、2または5日間培養した。培養終了後、細胞を十分洗浄した後、50 nM
[3H]NAを加え37℃で10分間インキュベーションして取り込みを行った。(4)C6細胞に熱
ストレス処置し、あるいはリチウムを添加して培養し、セロトニンまたはトロンビン刺激
性の細胞内Ca2+濃度上昇(fura-2蛍光強度)を検討した。また、上記に対するheat shock
protein (HSP) 合成阻害薬クエルセチン、プロテアーゼ阻害薬DEVD、セリンプロテア-
ゼのプラスミンの効果も検討した。(5)単極性うつ病患者および対照患者死後脳の前頭
葉皮質から調整した膜標本でアデニル酸シクラーゼ (AC) 活性、セロトニン刺激性ホスフ
ォリパーゼC (PLC) 活性、I 型AC、PLCb、総CREB、リン酸化CREB蛋白量を検討した。大う
つ病患者および対照患者から得た血小板のセロトニン刺激性細胞内Ca2+濃度変化も検討し
た。
結果と考察
(1)RNA-fingerprinting法では、対照群と比較し、イミプラミン、サート
ラリン連投ラットの脳から得たRNAサンプルに共通して増加しているPCR産物は74種あっ
た。それらにはHSC70のsplice variant, frizzled-3-protein (遺伝子欠損によりWillia
ms症候群生じる), cysteine string protein (神経終末Ca2+チャネル抑制に関与)、 kf-
1 (Zing finger domainを有する直早期遺伝子の候補)のほか rin (Ras ス-パ-ファミ
リー)、 thioredoxin (グルココルチコイド受容体や転写調節因子の機能調節に関与) の
類縁遺伝子などがあり、その多くでmRNA発現あるいは蛋白発現の増加を再確認した。(2
)ラット大脳皮質前頭部、海馬内のリン酸化CREBは、拘束ストレスあるいはパロキセチン
投与により増大した。ストレス脆弱性ラットではリン酸化CREBはより増大した。一方、カ
ルシニューリン mRNA発現量は拘束ストレス負荷、抗うつ薬投与後のいずれでも明らかな
変動はなかった。(3)イミプラミン、アミトリプチリン、デシプラミン、ノルトリプチ
リン、ニソキセチンの5日間添加によりNA取り込みとNAT mRNAの発現量も濃度依存的に抑
制された。セロトニンまたはドパミン選択的取り込み阻害薬や抗精神分裂病薬、抗てんか
ん薬では明確な効果はなかった。(4)リチウムの24時間処置はC6細胞のトロンビン刺激
性細胞内Ca2+ 濃度上昇を抑制したが、リチウム前処置はプラスミン処置による同じ抑制
効果に対して相加作用を示さず、百日咳毒素処置は相加作用を示した。このことはリチウ
ムの作用点がGq, Giとは独立でプラスミンの作用部位と共通である可能性を示している。
熱ストレス負荷後、セロトニン刺激性細胞内Ca2+ 濃度上昇は抑制されるが、クエルセチ
ン前処置あるいはDEVD前処置により抑制からの回復が阻害された。(5)うつ病患者の前
頭葉皮質では健常者に比較し、Ca2+/カルモジュリン存在下のAC活性、I 型AC蛋白量、セ
ロトニン刺激性PLC活性、PLCb蛋白量は有意に増加し、総CREB、リン酸化CREB蛋白量は低
下していた。一方、うつ病患者の血小板では健常者に比較しセロトニン刺激性細胞内Ca2+
濃度増加が有意に大きく、この増加に対するフォルスコリン誘導体NKH477前処理の抑制率
は有意に低下していた。
以上の結果から、Differential Display法を用いて抗うつ薬連投後にラット前頭皮質で複
数の遺伝子の発現が増加している可能性が示された。これらの遺伝子産物にはストレス蛋
白や神経機能との関連が推測される蛋白、遺伝子の転写活性に影響を与えると予想される
蛋白も含まれた。長期投与後に薬効が認められる抗うつ薬の作用機序には何らかの機能蛋
白の発現を含む脳内の可塑的変化がその基盤となっている可能性も高く、今回示した遺伝
子産物はその機能から考えるといずれも興味深い。一方、神経機能の長期的、可塑的な調
節に深く関与することが報告されている既知の細胞内情報伝達系に関しては、ストレス負
荷、抗うつ薬(あるいはリチウム)投与のいずれの場合もセカンドメッセンジャー系(Ca
2+、cAMP産生系)の変化が生じる可能性が示唆された。これがさらにプロテインキナーゼ
類によるCREB等の転写因子のリン酸化レベルの変化を介し、長期的な神経機能の変化をも
たらすという仮説も想定される。これらの実験結果を裏付けるように、うつ病患者の死後
脳ではcAMP産生系、IPs産生系の不均衡が生じるとともにリン酸化CREB蛋白量は低下して
いた。また、うつ病患者血小板のCa2+動態の変動も示唆されたことより、うつ病の病態に
細胞内情報伝達系の機能異常が関与している可能性が示された。
RNA-fingerprinting法により抗うつ薬投与時に増加することが推測された遺伝子産物と、
他の分担研究で明らかになったストレス負荷や抗うつ薬投与時、あるいはうつ病患者での
各種細胞内情報伝達系の変動との関連性は興味深く、今後は両者の相互関係についても検
討を加える。
ラリン連投ラットの脳から得たRNAサンプルに共通して増加しているPCR産物は74種あっ
た。それらにはHSC70のsplice variant, frizzled-3-protein (遺伝子欠損によりWillia
ms症候群生じる), cysteine string protein (神経終末Ca2+チャネル抑制に関与)、 kf-
1 (Zing finger domainを有する直早期遺伝子の候補)のほか rin (Ras ス-パ-ファミ
リー)、 thioredoxin (グルココルチコイド受容体や転写調節因子の機能調節に関与) の
類縁遺伝子などがあり、その多くでmRNA発現あるいは蛋白発現の増加を再確認した。(2
)ラット大脳皮質前頭部、海馬内のリン酸化CREBは、拘束ストレスあるいはパロキセチン
投与により増大した。ストレス脆弱性ラットではリン酸化CREBはより増大した。一方、カ
ルシニューリン mRNA発現量は拘束ストレス負荷、抗うつ薬投与後のいずれでも明らかな
変動はなかった。(3)イミプラミン、アミトリプチリン、デシプラミン、ノルトリプチ
リン、ニソキセチンの5日間添加によりNA取り込みとNAT mRNAの発現量も濃度依存的に抑
制された。セロトニンまたはドパミン選択的取り込み阻害薬や抗精神分裂病薬、抗てんか
ん薬では明確な効果はなかった。(4)リチウムの24時間処置はC6細胞のトロンビン刺激
性細胞内Ca2+ 濃度上昇を抑制したが、リチウム前処置はプラスミン処置による同じ抑制
効果に対して相加作用を示さず、百日咳毒素処置は相加作用を示した。このことはリチウ
ムの作用点がGq, Giとは独立でプラスミンの作用部位と共通である可能性を示している。
熱ストレス負荷後、セロトニン刺激性細胞内Ca2+ 濃度上昇は抑制されるが、クエルセチ
ン前処置あるいはDEVD前処置により抑制からの回復が阻害された。(5)うつ病患者の前
頭葉皮質では健常者に比較し、Ca2+/カルモジュリン存在下のAC活性、I 型AC蛋白量、セ
ロトニン刺激性PLC活性、PLCb蛋白量は有意に増加し、総CREB、リン酸化CREB蛋白量は低
下していた。一方、うつ病患者の血小板では健常者に比較しセロトニン刺激性細胞内Ca2+
濃度増加が有意に大きく、この増加に対するフォルスコリン誘導体NKH477前処理の抑制率
は有意に低下していた。
以上の結果から、Differential Display法を用いて抗うつ薬連投後にラット前頭皮質で複
数の遺伝子の発現が増加している可能性が示された。これらの遺伝子産物にはストレス蛋
白や神経機能との関連が推測される蛋白、遺伝子の転写活性に影響を与えると予想される
蛋白も含まれた。長期投与後に薬効が認められる抗うつ薬の作用機序には何らかの機能蛋
白の発現を含む脳内の可塑的変化がその基盤となっている可能性も高く、今回示した遺伝
子産物はその機能から考えるといずれも興味深い。一方、神経機能の長期的、可塑的な調
節に深く関与することが報告されている既知の細胞内情報伝達系に関しては、ストレス負
荷、抗うつ薬(あるいはリチウム)投与のいずれの場合もセカンドメッセンジャー系(Ca
2+、cAMP産生系)の変化が生じる可能性が示唆された。これがさらにプロテインキナーゼ
類によるCREB等の転写因子のリン酸化レベルの変化を介し、長期的な神経機能の変化をも
たらすという仮説も想定される。これらの実験結果を裏付けるように、うつ病患者の死後
脳ではcAMP産生系、IPs産生系の不均衡が生じるとともにリン酸化CREB蛋白量は低下して
いた。また、うつ病患者血小板のCa2+動態の変動も示唆されたことより、うつ病の病態に
細胞内情報伝達系の機能異常が関与している可能性が示された。
RNA-fingerprinting法により抗うつ薬投与時に増加することが推測された遺伝子産物と、
他の分担研究で明らかになったストレス負荷や抗うつ薬投与時、あるいはうつ病患者での
各種細胞内情報伝達系の変動との関連性は興味深く、今後は両者の相互関係についても検
討を加える。
結論
(1)RNA-fingerprinting法により、抗うつ薬の連続投与後にラット前頭葉皮質で
発現量が変化する遺伝子群 を見出した。(2)脳内の転写因子CREBのリン酸化は、拘束
ストレス負荷および抗うつ薬投与で亢進し、ストレス脆弱ラットではその程度は大きかっ
た。一方、カルシニューリンの mRNA発現の変化は認められなかった。(3)抗うつ薬の
長期添加によりPC12細胞のNA取り込み能とNAT mRNA発現が抑制された。(4)ストレス負
荷や気分安定薬リチウムによる神経系細胞の細胞内Ca2+動員系の抑制にはプロテア-ゼが
関与し、その回復にはHSP70の発現が関与していた。(5)うつ病死後脳ではcAMP産生系
の亢進に関わらずCREBのリン酸化の低下が認められた。また、うつ病患者の血小板では5-
HT刺激性Ca2+動員のcAMP系による抑制が低下しており、cAMP系とIPs系の不均衡が推測さ
れた。以上より、うつ病の発症機序と治癒機転にはCa2+動員、cAMP産生系やリン酸化能を
含む細胞内情報伝達系やストレス蛋白の活性変化とともに、転写調節因子も含む各種未知
遺伝子産物も関与している可能性が示された。
発現量が変化する遺伝子群 を見出した。(2)脳内の転写因子CREBのリン酸化は、拘束
ストレス負荷および抗うつ薬投与で亢進し、ストレス脆弱ラットではその程度は大きかっ
た。一方、カルシニューリンの mRNA発現の変化は認められなかった。(3)抗うつ薬の
長期添加によりPC12細胞のNA取り込み能とNAT mRNA発現が抑制された。(4)ストレス負
荷や気分安定薬リチウムによる神経系細胞の細胞内Ca2+動員系の抑制にはプロテア-ゼが
関与し、その回復にはHSP70の発現が関与していた。(5)うつ病死後脳ではcAMP産生系
の亢進に関わらずCREBのリン酸化の低下が認められた。また、うつ病患者の血小板では5-
HT刺激性Ca2+動員のcAMP系による抑制が低下しており、cAMP系とIPs系の不均衡が推測さ
れた。以上より、うつ病の発症機序と治癒機転にはCa2+動員、cAMP産生系やリン酸化能を
含む細胞内情報伝達系やストレス蛋白の活性変化とともに、転写調節因子も含む各種未知
遺伝子産物も関与している可能性が示された。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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