ワクチン基礎生産技術の向上に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201407014A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ワクチン基礎生産技術の向上に関する研究
• 課題番号: H24-創薬総合-一般-005
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 森 康子(神戸大学 大学院医学研究科)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 【補助金】 創薬基盤推進研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究費: 23,037,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　水痘生ワクチンは世界中で広く使用されている水痘に対する有効なワクチンである。日本で確立されたOkaワクチン株（vOka）は現在世界中で使用されている。我々は他の病原体の遺伝子をvOkaゲノムに組み込んだ組換え水痘ウイルスを作製し、水痘ウイルスおよび他の病原体の感染も同時に防御できる多価ワクチンの開発を目指している。本研究ではそのvOka ゲノムにRSVの遺伝子を組み込んだ組換え水痘ウイルスを作製し、有効性を検討することを目的とした。本年度は作製した組換え水痘ウイルスをモルモットに複数回接種することでRSVに対する有効性を検討した。
　さらに細胞性免疫能を測定するための系の確立を目指した。

研究方法

１．rvOka-RSV-A-F、rvOka-RSV-B-Fセルフリーウイルスを、モルモットへ経気道接種で免疫した。接種は複数回（３回）行った。その後、採血をして血清中の抗体価測定を行った。間接蛍光抗体法 (IFA) によりRSV-Fに対する抗体価を測定した。同時に、RSVと水痘ウイルスに対する中和抗体価をプラークリダクションアッセイで測定した。標的ウイルスとして RSV-Long株、RSV-9320株（共にATCCより購入）、VZV-vOka株を用いた。
2. モルモットIFN-γ遺伝子をヒト抗体のFc部分とfusionさせ、そのC末端にヒスチジンタグを付加した。次に、そのモルモットIFN-γ遺伝子カセットを哺乳類細胞発現ベクターにクローニングした。作製したベクターを293T細胞に導入し、その培養上清を回収した。最後に、回収した培養上清から、Ni-NTAを用いて、モルモットIFN-γの精製を行った。上記で精製したモルモットIFN-γ抗原を複数回マウスに免疫後リンパ節を採取し、それらから分離した細胞をマウスの骨髄がん細胞であるSP2細胞と融合させ、数種のハイブリドーマを樹立した。モノクローナル抗体のスクリーニングは、モルモットIFN-γを発現させた293Ｔ細胞を用いた間接蛍光抗体法により行った。モルモットIFN-γ遺伝子を発現させた293Ｔ細胞を溶解し、その溶解液と作製したモルモットIFN-γモノクローナル抗体を用いた免疫沈降法にて、作製した抗体とモルモットIFN-γとの結合を調べた。

結果と考察

1. モルモットへの免疫による検討
免疫回数を増やすことでrvOka-RSV-A-F又はrvOka-RSV-B-Fで免疫した両群で、IFAによりRSV-A-FとRSV-B-Fの両方に対する抗体価の上昇が確認された。加えて、免疫回数を増やすことで、rvOka-RSV-A-F又はrvOka-RSV-B-Fを接種した群で、RSV-A型とRSV-B型の両方に対する中和抗体が誘導されていた。

2.モルモットIFN-γの作製と抗体作製
我々は感度の高いモルモットIFN-γ抗体を作製するため、ナチュラルフォームのモルモットIFN-γ抗原の作製を試みた。我々はモルモットIFN-γ遺伝子を哺乳類細胞発現ベクターに挿入し、作製したベクターを哺乳類細胞である293T細胞に導入した後、その培養上清中からのモルモットIFN-γタンパク質の精製に成功した 。上記で精製した抗原をマウスに免疫し、そのリンパ節から、2クローンのモルモットIFN-γ抗体を分泌するハイブリドーマを樹立することができた。

結論

今後は実用化を目指した臨床研究へ進めていく必要がある。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-04-22
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201407014B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ワクチン基礎生産技術の向上に関する研究
• 課題番号: H24-創薬総合-一般-005
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 森 康子(神戸大学 大学院医学研究科)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 【補助金】 創薬基盤推進研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

現行の水痘（VZV）ワクチン株である岡株vOKaは、水痘患者より分離したウイルスOka原株pOkaを、継代を繰り返すことにより弱毒化した生ウイルスワクチンである。
我々はこれまでに、この水痘ワクチン株をベクターとし、ムンプスウイルスの表面抗原遺伝子を挿入し、ムンプスウイルスの外来遺伝子を発現する組換え水痘ワクチンウイルスを用いてその効果を明らかにしてきた。
本研究では、その水痘ワクチン株ゲノムにRSV抗原の遺伝子として、RSV-A型のFタンパク質 (RSV-A-F)あるいはGタンパク質 (RSV-A-G)、そしてRSV-B型のFタンパク質 (RSV-B-F)を挿入することを試みた。さらにこれらのワクチンウイルスをモルモットに免疫し、その有効性を検討した。

研究方法

(1) RSV抗原組換え水痘ワクチンウイルス作製
(2) モルモット免疫試験-感染細胞皮下接種
(３) モルモット免疫試験-経気道接種
(4)モルモットIFN-γに対するモノクローナル抗体の作製
(5) モルモットIFN-γを発現させたヒト由来細胞を用いたElispot実験
（６)水痘抗原刺激によるElispot スポット数の変化

結果と考察

　(1) RSV抗原組換え水痘ワクチンウイルス作製
RSV遺伝子を発現するvOka-BACゲノムを作製した。得られた外来遺伝子挿入vOka-RSV-BACゲノムを、VZV感染許容細胞 （MRC-5細胞） に導入し、組換え水痘ワクチンウイルスrvOka-RSV-A-F、rvOka-RSV-B-F、rvOka-RSV-A-Gを得た。

(2) モルモット免疫試験-感染細胞皮下接種
rvOka-RSV-A-FあるいはrvOka-RSV-A-Gを4回接種したモルモットの血清中においてRSV-A-FあるいはRSV-A-Gに対する抗体価の上昇が確認された。　VZVに対する中和抗体の誘導は認められた。そしてRSV-Long株 （RSV-A型） に対しては中和抗体の誘導が確認できた。しかし、RSV-9320株 （RSV-B型） に対する中和抗体の誘導は確認できなかった。

(３) モルモット免疫試験-経気道接種
rvOka-RSV-A-FあるいはrvOka-RSV-B-Fをモルモットに経気道的に３回接種した。結果、rvOka-RSV-A-FあるいはrvOka-RSV-B-Fを免疫した両群において、IFAによりRSV-A-FおよびRSV-B-Fの両方に対する抗体価の上昇が確認された。水痘ウイルスに対する中和抗体の誘導は、コントロールの水痘生ワクチン株接種群も含めて確認することができた。加えてrvOka-RSV-A-FあるいはrvOka-RSV-B-F接種群において、RSV-A型とRSV-B型の両方に対する中和抗体が誘導されていた。

(4)モルモットIFN-γに対するモノクローナル抗体の作製
モルモットIFN-γを作製、精製し、マウスに免疫した。免疫したマウスからリンパ節を採取し、モノクローナル抗体を作製した。
複数のモルモットIFN-γハイブリドーマの樹立に成功した。それらのハイブリドーマから産生された抗体のエピトープ を調べるために、部分欠損したモルモットIFN-γ遺伝子を発現した細胞を用いて、間接蛍光抗体法を行った。結果うち1つの抗体のエピトープ がモルモットIFN-γのN末端側に、残りの3つはC末端側にあることが明らかとなった。このことから、少なくとも、2種類以上のエピトープ を認識する抗体を作製することができた。

(5) モルモットIFN-γを発現させたヒト由来細胞を用いたElispot実験
上記で作製した抗体がIFN-γElispot法に使用できるか否かを調べるため、モルモットIFN-γを発現させた細胞を用いて、IFN-γElispot実験を行った。その結果、モルモットIFN-γ発現細胞を用いたサンプルでは、モルモットIFN-γを発現しない細胞に比べ、明らかにスポット数が上昇していた。

結論

本研究でのモルモット免疫試験rvOka-RSV-A-Fや、rvOka-RSV-B-Fの３回の経気道接種によってモルモットの血清中に、RSV-A型とRSV-B型の両方に対する中和抗体の誘導を確認することができた。本研究成果は、これらのワクチンウイルスの接種によりRSVの両型のウイルス感染を防御できる二価ワクチンと成り得る可能性を示している。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-04-28
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201407014C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 水痘ワクチンウイルスのゲノムに種々の外来抗原となる遺伝子を挿入した組換えウイルスを作製し、その組換えウイルスをワクチンとして用いることより専門的および学術的にも興味深いと考えられる。
• 臨床的観点からの成果: 本組換えワクチンが実用化されればこの組換えウイルスの接種により、複数の感染症に対する発症の予防効果が期待できる。
• ガイドライン等の開発: 組換えワクチンのガイドライン開発を目指している。
• その他行政的観点からの成果: ワクチンが開発され、投与が施行されれば、病気の発症予防につながり医療費の削減につながる。さらに国民の健康維持にもつながる。
• その他のインパクト: 本研究成果はシンポジウムなどで発表した。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 1件
• その他論文(和文): 1件
• その他論文(英文等): 1件
• 学会発表(国内学会): 5件
• 学会発表(国際学会等): 2件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Murakami K, Matsuura M, Ota M, Gomi Y et al.; A recombinant varicella vaccine harboring a respiratory syncytial virus gene induces humoral immunity; Vaccine (2015); 10.1016/j.vaccine.2015.04.101

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: 2018-06-11

収支報告書

• 文献番号: 201407014Z