文献情報
文献番号
201324124A
報告書区分
総括
研究課題名
希少難治性心疾患由来ｉＰＳ細胞を用いた左心低形成症候群の予後因子の解明に関する研究
課題番号
H25-難治等（難）-一般-008
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
王 英正(岡山大学病院 新医療研究開発センター 再生医療部)
研究分担者(所属機関)
- 佐野俊二(岡山大学医歯薬学総合研究科 心臓血管外科)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 難治性疾患等克服研究（難治性疾患克服研究）
研究開始年度
平成25(2013)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
9,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
単心室循環を示す左心低形成症候群は1万人に1人の頻度で年間約1,000人が出生し、極めて予後が不良の希少難治性心疾患である。一方、乳幼児における心臓移植の実績がない我が国では、生後直後より3期にわたる心臓手術が唯一の治療法であり、5年生存率は約60％と限界がある。このため、標準外科的治療後の中長期における生命予後を予測する方法を開発することは、治療戦略上、心臓移植適応候補者を選定する面からも重要な研究課題である。
本研究では、申請者らがこれまでに樹立してきた6株の疾患特異的iPS細胞（左心低形成症候群5株と二心室心1株）を心筋細胞に分化誘導させ、網羅的遺伝子解析で得られた左心低形成症候群に固有な心臓発生転写因子群の発現パターンに注目し、心臓手術後の継続的な臨床疫学調査データと照合することで、術後心不全の再発や心不全死の独立予後規定因子を解明する。
本研究では、申請者らがこれまでに樹立してきた6株の疾患特異的iPS細胞（左心低形成症候群5株と二心室心1株）を心筋細胞に分化誘導させ、網羅的遺伝子解析で得られた左心低形成症候群に固有な心臓発生転写因子群の発現パターンに注目し、心臓手術後の継続的な臨床疫学調査データと照合することで、術後心不全の再発や心不全死の独立予後規定因子を解明する。
研究方法
iPS細胞作製技術は、既に疾患を発症した患者の体組織細胞を初期化することで、疾患発症前に遺伝子情報をリセットでき、かつ継時的に疾患発症にかかわる遺伝子発現異常を網羅することができる。
1.申請者らは5株の疾患特異的iPS細胞を用いて、単心室心の解剖発生学的異常を規定する4つの転写因子群（Nkx2.5, isl1, Tbx5, Hand2）の発現が著明に低下し、収縮能が著しく障害されていることを明らかにした。
2.本研究では、初年度に10株以上の新規左心低形成症候群由来のiPS細胞を樹立し、流入や流出路閉鎖を伴う重篤性が高い本疾患の心臓発生異常に関わる分子制御機序について網羅的に解明する。
3.心臓手術後における心不全症状の再燃や心不全死の有無を中心に、iPS細胞の機能解析した全症例に関する房室弁逆流の遅発性発症や蛋白漏出性腸症の合併について追跡調査する。
4.本研究班を共同研究拠点とし、疫学調査成果を評価後、「次世代遺伝子解析による希少難治性循環器疾患の診断治療法の開発」研究班に情報提供し、予後診断ガイドラインを作成する。
1.申請者らは5株の疾患特異的iPS細胞を用いて、単心室心の解剖発生学的異常を規定する4つの転写因子群（Nkx2.5, isl1, Tbx5, Hand2）の発現が著明に低下し、収縮能が著しく障害されていることを明らかにした。
2.本研究では、初年度に10株以上の新規左心低形成症候群由来のiPS細胞を樹立し、流入や流出路閉鎖を伴う重篤性が高い本疾患の心臓発生異常に関わる分子制御機序について網羅的に解明する。
3.心臓手術後における心不全症状の再燃や心不全死の有無を中心に、iPS細胞の機能解析した全症例に関する房室弁逆流の遅発性発症や蛋白漏出性腸症の合併について追跡調査する。
4.本研究班を共同研究拠点とし、疫学調査成果を評価後、「次世代遺伝子解析による希少難治性循環器疾患の診断治療法の開発」研究班に情報提供し、予後診断ガイドラインを作成する。
結果と考察
先天性心疾患由来の心臓手術中に余剰となった右心房由来の少量組織を用いて、疾患特異的iPS細胞の樹立に成功した。解析対象とする単心室症である左心低形成症候群のiPS細胞を5株、比較対照として、二心室心である総肺静脈還流異常症1株と京都大学で樹立した201B7細胞をコントロール細胞とした。樹立した各iPS細胞のOCT4とNANOGのプロモーター領域におけるDNAの脱メチル化解析ならびに網羅的遺伝子解析において、コントロール細胞の胚性幹細胞と同様の初期化形態を示していることを確認した。左心低形成症候群由来のiPS細胞は二心室心由来の細胞に比し心筋細胞に分化する速度が遅く分化度も低い。この分化制御機構を調べるために、ダイレクトシークエンス法用いて、NKX2-5、HAND1、NOTCH1の遺伝子変異を解析した結果、NKX2-5で1か所、NOTCH1で5か所の同義一塩基多型(SNPs)を認めた。さらに、ChIP解析によるエピジェネティック解析では、左心低形成症候群由来iPS細胞においてH3K4me2とacH3が減少する一方、H3K27me3は二心室心より有意に増加していた。また、網羅的遺伝子解析でNKX2-5、HAND1/2、TBX2、NOTCH1、HEY1/2といった複数の心臓初期転写因子群に発現量の異常を同定した。うち、NKX2-5、NOTCH1、HAND1について、gain及びloss of functionの検討を加えた。心筋特異的構造蛋白であるトロポニン-T及びNPPAのプロモーター解析では、NKX2-5、NOTCH1、HAND1の一過性過剰発現により活性が相乗的に上昇し、二心室心由来iPS細胞ではこれらを個別に抑制するshRNAの導入により、プロモーター活性が有意に低下した。
結論
本研究の成果によって、通常の二心室心に比べ単心室心である左心低形成症候群由来のiPS細胞では、左室流出路、中隔形成や弁形成に重要な各種転写因子群の発現量の低下が確認された。本研究成果により、NKX2-5, HAND1, NOTHCH1の発現調節が疾患発症に重要であることが明らかとなった。今後は得られた研究成果に基づき、登録した左心低形成症候群症例の長期予後を追跡する。
公開日・更新日
公開日
2015-06-30
更新日
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