文献情報
文献番号
201321014A
報告書区分
総括
研究課題名
免疫系を保持した次世代型Ｂ型肝炎ウイルス感染小動物モデルの開発とその応用
課題番号
H24-Ｂ創-肝炎-一般-015
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
竹原 徹郎(大阪大学大学院 医学研究科 消化器内科学)
研究分担者(所属機関)
- 巽 智秀(大阪大学大学院 医学系研究科 消化器内科学)
- 疋田 隼人(大阪大学大学院 医学系研究科 消化器内科学)
- 上田 啓次(大阪大学大学院 医学系研究科 ウイルス学)
- 水口 裕之(大阪大学大学院 薬学研究科 分子生物学分野)
- 北島 健二(公益財団法人東京都医学総合研究所 生体分子先端研究分野)
- 末水 洋志(公益財団法人実験動物中央研究所 実験動物研究部 バイオメディカル研究室)
- 高橋 武司(公益財団法人実験動物中央研究所 実験動物研究部 免疫研究室)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 B型肝炎創薬実用化等研究経費
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成28(2016)年度
研究費
100,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
B型肝炎の病態の解明や画期的な治療法の確立にはモデル動物を用いた研究が必要である。実験動物として長く使用され遺伝的な解析も進んだ小動物としてマウスの感染モデルの開発が望まれている。本研究課題では免疫機能を有し、より取扱いが容易で安定したHBV感染・増殖小動物モデルの開発を行う。そして、HBVとヒト肝細胞、ヒト免疫細胞の複雑な相互作用を解析できる次世代型のHBV感染小動物モデルを開発することを目標とする。
研究方法
（１）ハイドロダイナミック法を用いたHBV増殖に対する免疫応答の解析
1.2倍超のHBVゲノムをタンデムにつないだ増殖可能なHBVコンストラクトを作成する。これらの遺伝子をハイドロダイナミック法にてマウスに投与し、ウイルス増殖能と免疫応答を評価する。
（２）マウス免疫系のヒト細胞による再構成とHBV増殖に対するヒト免疫応答の解析
MHC class I/IIを欠損したNOGマウス（NOG-DKO）を作成する。ヒト末梢血単核球（PBMC）を投与し、経時的なGVHD反応、生着率を評価する。HBsワクチン接種、HBV 発現プラスミドのハイドロダイナミック投与を行い、免疫応答を解析する。
（３）マウス免疫機能を保持したヒト肝細胞置換マウスの作成とその解析
肝形成不全、持続的肝障害マウスの胎生16.5日に卵黄嚢静脈よりヒト初代培養肝細胞を投与し、ヒト肝細胞に対して免疫寛容が成立したマウスの作成を行う。
（４）ヒト肝細胞置換マウスの作成と免疫系のヒト細胞による再構成
肝細胞ヒト化TK-NOGマウスを作成する。HBV患者血清を投与し、HBV感染性を検討する。また、肝細胞特異的にMcl-1をKOした持続肝障害マウスとNOGマウスを戻し、このマウスでも肝細胞キメラマウスを作成する。さらに臍帯血由来ヒト造血幹細胞を投与し、免疫細胞のヒト化も検討する。
（５）ES細胞、iPS細胞を用いた肝臓と免疫系のヒト細胞再構成
ヒトiPS細胞からアデノウイルスベクターを用いてFOXA2遺伝子、HNF1a遺伝子を導入し、分化度の高い肝細胞を誘導する。誘導したiPS細胞を用いてヒト肝細胞キメラマウスを作成する。また、ES/iPS由来造血幹細胞が生着・分化する至適条件を検討する。そして、マウスの個体内で同系のヒト細胞が相互作用するモデルの作成を行う。
1.2倍超のHBVゲノムをタンデムにつないだ増殖可能なHBVコンストラクトを作成する。これらの遺伝子をハイドロダイナミック法にてマウスに投与し、ウイルス増殖能と免疫応答を評価する。
（２）マウス免疫系のヒト細胞による再構成とHBV増殖に対するヒト免疫応答の解析
MHC class I/IIを欠損したNOGマウス（NOG-DKO）を作成する。ヒト末梢血単核球（PBMC）を投与し、経時的なGVHD反応、生着率を評価する。HBsワクチン接種、HBV 発現プラスミドのハイドロダイナミック投与を行い、免疫応答を解析する。
（３）マウス免疫機能を保持したヒト肝細胞置換マウスの作成とその解析
肝形成不全、持続的肝障害マウスの胎生16.5日に卵黄嚢静脈よりヒト初代培養肝細胞を投与し、ヒト肝細胞に対して免疫寛容が成立したマウスの作成を行う。
（４）ヒト肝細胞置換マウスの作成と免疫系のヒト細胞による再構成
肝細胞ヒト化TK-NOGマウスを作成する。HBV患者血清を投与し、HBV感染性を検討する。また、肝細胞特異的にMcl-1をKOした持続肝障害マウスとNOGマウスを戻し、このマウスでも肝細胞キメラマウスを作成する。さらに臍帯血由来ヒト造血幹細胞を投与し、免疫細胞のヒト化も検討する。
（５）ES細胞、iPS細胞を用いた肝臓と免疫系のヒト細胞再構成
ヒトiPS細胞からアデノウイルスベクターを用いてFOXA2遺伝子、HNF1a遺伝子を導入し、分化度の高い肝細胞を誘導する。誘導したiPS細胞を用いてヒト肝細胞キメラマウスを作成する。また、ES/iPS由来造血幹細胞が生着・分化する至適条件を検討する。そして、マウスの個体内で同系のヒト細胞が相互作用するモデルの作成を行う。
結果と考察
（１）Genotype AおよびCのHBV発現プラスミドを作成し、NODマウス、NOD-SCIDマウス（T、B細胞欠損）、NOGマウス（T、B、NK細胞欠損）に投与した。肝細胞でHBVの発現とともに、HBs抗原血症およびウイルス血症が成立した。NODマウスではウイルス血症は一過性であったが、NOD-SCID、NOGマウスでは遷延化し、高いウイルス血症を示した。またGenotype AではCに比し高いウイルス血症を示した。
（２）NOG-MHC class I/class II KOマウスにヒトPBMCを静注すると、肝臓において移植後28日で約90%がヒト細胞に置換した。NOGマウスに比し、GVH応答は抑制された。HBsワクチンを投与により、50%のマウスでHBs抗体の上昇がみられた。ハイドロダイナミック法によるHBV発現により、HBcペプチドに対するT細胞応答が誘導された。
（３）Bcl-xL/Mcl-1 KOマウスおよび野生型マウスのED16.5の胎児の卵黄嚢静脈よりGFP Tgマウス由来の初代培養肝細胞を投与し、生下時にGFP陽性肝細胞がマウス肝臓内に生着していることを確認した。Mcl-1 KO (C57BL系統) マウスを免疫不全化するため、スピードコンジェニック法によるNOGマウスへの戻し交配をN５世代まで行った。
（４）ヒト肝細胞への置換率が30～70%のTK-NOGマウスにHBVを投与することにより、持続的な感染が成立した。その後ヒトPBMCを投与することにより、肝障害が誘導され、血中ウイルス量が低下した。ヒトの肝臓と免疫の両者を有するTK-NOG-MHC class I/class II KOマウスの作成を開始した。
（５）ヒトiPS細胞由来分化誘導肝細胞を肝障害免疫不全マウスへ移植し、生着することを確認した。ヒト肝細胞からゲノムインテグレーションフリー・ヒトiPS細胞株を多数樹立した。マウスES/iPS細胞に対して、転写因子Lhx2を調節することにより、造血幹細胞を誘導し、さらに造血細胞、免疫細胞への分化が誘導できた。
（２）NOG-MHC class I/class II KOマウスにヒトPBMCを静注すると、肝臓において移植後28日で約90%がヒト細胞に置換した。NOGマウスに比し、GVH応答は抑制された。HBsワクチンを投与により、50%のマウスでHBs抗体の上昇がみられた。ハイドロダイナミック法によるHBV発現により、HBcペプチドに対するT細胞応答が誘導された。
（３）Bcl-xL/Mcl-1 KOマウスおよび野生型マウスのED16.5の胎児の卵黄嚢静脈よりGFP Tgマウス由来の初代培養肝細胞を投与し、生下時にGFP陽性肝細胞がマウス肝臓内に生着していることを確認した。Mcl-1 KO (C57BL系統) マウスを免疫不全化するため、スピードコンジェニック法によるNOGマウスへの戻し交配をN５世代まで行った。
（４）ヒト肝細胞への置換率が30～70%のTK-NOGマウスにHBVを投与することにより、持続的な感染が成立した。その後ヒトPBMCを投与することにより、肝障害が誘導され、血中ウイルス量が低下した。ヒトの肝臓と免疫の両者を有するTK-NOG-MHC class I/class II KOマウスの作成を開始した。
（５）ヒトiPS細胞由来分化誘導肝細胞を肝障害免疫不全マウスへ移植し、生着することを確認した。ヒト肝細胞からゲノムインテグレーションフリー・ヒトiPS細胞株を多数樹立した。マウスES/iPS細胞に対して、転写因子Lhx2を調節することにより、造血幹細胞を誘導し、さらに造血細胞、免疫細胞への分化が誘導できた。
結論
上記５つのステップについて今年度はほぼ当初の予定通りの計画を達成した。個々のステップを統合していくことにより、最終的に免疫系が保持され、肝細胞が長期安定して置換され、ヒトの同系細胞が相互作用する次世代型HBV感染小動物モデルを作成し、創薬研究に応用できると考える。
公開日・更新日
公開日
2015-06-03
更新日
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