文献情報
文献番号
201321003A
報告書区分
総括
研究課題名
Ｂ型肝炎ウイルスの感染複製機構の解明に関する研究
課題番号
H24-Ｂ創-肝炎-一般-004
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
脇田 隆字(国立感染症研究所 ウイルス第二部)
研究分担者(所属機関)
- 鈴木 哲朗(浜松医科大学 感染症学講座)
- 梁 明秀(横浜市立大学 医学部微生物学)
- 朴 三用(横浜市立大学 生命ナノシステム科学研究科)
- 菅 裕明(東京大学大学院 理学系研究科)
- 千葉 勉(京都大学 医学部消化器内科学)
- 加藤 直也(東京大学 医科学研究所)
- 飯島 沙幸(名古屋市立大学 ウイルス学)
- 堀田 博(神戸大学大学院 医学研究科)
- 宮城 琢也(大阪大学大学院 医学系研究科)
- 加藤 孝宣(国立感染症研究所 ウイルス第二部 )
- 岡本 徹(大阪大学 微生物病研究所)
- 榎本 信幸(山梨大学 医学部第一内科)
- 馬場 昌範(鹿児島大学 大学院医歯学総合研究科)
- アクバル シェイクモハマドファズレ(東芝病院 研究部)
- 森川 賢一(昭和大学 医学部内科学講座)
- 豊田 哲也(医療法人さわらび会福祉村病院 長寿医学研究所)
- 有海 康雄(熊本大学 エイズ学研究センター)
- 朝比奈 靖浩(東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究科)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 B型肝炎創薬実用化等研究経費
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成28(2016)年度
研究費
200,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
Ｂ型肝炎の治療では逆転写酵素阻害剤が導入されて、抗ウイルス療法が可能となった。しかし、逆転写酵素阻害剤単剤の治療ではウイルス排除に向けた根治は困難で、またウイルス量の制御のために抗ウイルス薬を中止することも難しい。さらに薬剤耐性ウイルス出現のリスクがある。従って、多くのHBVキャリアの治療法開発、改善のために新たな抗HBV治療薬の開発が望まれている。本研究ではＢ型肝炎の新規治療薬開発に向けて、HBVの感染複製増殖機構の解明を目指す。
研究方法
HBVの生活環の各過程を網羅的かつ詳細に検討し、関与する宿主因子の同定などを通じてそのメカニズムを解明する。さらに、各過程の解析から新たな抗ウイルス薬標的を同定する。下記の研究項目について研究を進める。
１．ウイルス生活環各ステップを制御する因子の同定とその分子メカニズム解析
２．初期感染過程（ウイルス吸着から侵入、核への輸送）の解析
３．cccDNA転写機構、ウイルスゲノムインテグレーション機構、ウイルスゲノム複製機構の解析
４．ウイルス構造蛋白質、逆転写酵素の発現、酵素活性、構造の解析
５．ウイルス粒子形成および分泌機構の解析
６．HBc抗原、HBｘ抗原の発現、機能、構造の解析
１．ウイルス生活環各ステップを制御する因子の同定とその分子メカニズム解析
２．初期感染過程（ウイルス吸着から侵入、核への輸送）の解析
３．cccDNA転写機構、ウイルスゲノムインテグレーション機構、ウイルスゲノム複製機構の解析
４．ウイルス構造蛋白質、逆転写酵素の発現、酵素活性、構造の解析
５．ウイルス粒子形成および分泌機構の解析
６．HBc抗原、HBｘ抗原の発現、機能、構造の解析
結果と考察
１．ウイルス生活環の制御因子同定： HBV蛋白および複製複合体誘導化における約4000種類の蛋白の動態を比較定量的に評価した。cccDNA検出系を確立し、cccDNAを阻害する化合物をスクリーニングした。
２．初期感染過程の解析：NTCPがHBV感染に必須な因子であることを確認した。CsAがHBVの感染過程を阻害する事を明らかにした。CsAはNTCPに結合してそのトラスポーター活性を抑制してHBV感染を阻害する。NTCPとLHBsの相互作用をin vitroでハイスループットに検出するアッセイ系を構築した。
３．遺伝子発現および転写機構、インテグレーション機構の解析： 1)HBV mRNAの核外輸送機構解明ため、HBVゲノムのPRE結合因子をスクリーニングした。PREに結合しHBVプレゲノムRNAの分解促進に働きHBV産生を抑制する宿主因子としてhnRNP Uを同定した。2) HBV複製細胞において、p53やPML等の核内がん抑制因子、ATM、Chk2、DNA-PK、PARP1等のDNA損傷センサー、そして種々のRNAヘリケース等のノックダウン細胞を構築した。
４．ウイルス蛋白質発現、機能および構造の解析：カプシド蛋白を標的とした抗HBV薬の同定と開発を目的として， in silicoスクリーニングアッセイを実施し，選択的な抗HBV効果を示すリード化合物を同定した。無細胞系を用いて逆転写酵素タンパク質の可溶化に成功した。HBx、HBcおよびRTタンパク質をコムギ無細胞系により大量合成し、各タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製した。RNase H阻害剤スクリーニング系を開発した。また、試験管内逆転写系を開発した。
５．ウイルス粒子形成および分泌機構の解析：任意の時期に肝細胞にHBV全タンパク質を発現し、肝炎としての免疫応答を惹起する新規モデルマウス作成を進めている。F1マウスの肝組織にHBV RNAが発現誘導された。
６．HBｘ抗原の発現、機能、構造の解析： HBxタンパク質と特異的に結合するPrdx1を同定した。HBxタンパク質はNF-kBシグナル伝達系を始めとしてSRE、SRF、AP-1の各シグナル伝達系を活性化した。HBxタンパク質と相互作用する宿主因子として脱メチル化酵素であるJMJD5を同定した。JMJD5はHBxと直接結合し、HBVの粒子産生を抑制した。JMJD5はp53との相互作用が示唆されており、HBVの粒子産生にp53の関与を示す成績が得られた。
７．病原性解析、線維化、オートファジーの影響： HBV感染キメラマウスの線維化肝臓サンプルを用いてマイクロアレイ解析を行いHBV感染による遺伝子発現の変動を検証した。さらにデータからpathway解析を行い線維化に関わる推測されるsignal pathwayの抽出を行った。In vitroにおいて、オートファジーの抑制はHBV増殖を抑制し、オートファジーの促進はHBV増殖を促進した。
２．初期感染過程の解析：NTCPがHBV感染に必須な因子であることを確認した。CsAがHBVの感染過程を阻害する事を明らかにした。CsAはNTCPに結合してそのトラスポーター活性を抑制してHBV感染を阻害する。NTCPとLHBsの相互作用をin vitroでハイスループットに検出するアッセイ系を構築した。
３．遺伝子発現および転写機構、インテグレーション機構の解析： 1)HBV mRNAの核外輸送機構解明ため、HBVゲノムのPRE結合因子をスクリーニングした。PREに結合しHBVプレゲノムRNAの分解促進に働きHBV産生を抑制する宿主因子としてhnRNP Uを同定した。2) HBV複製細胞において、p53やPML等の核内がん抑制因子、ATM、Chk2、DNA-PK、PARP1等のDNA損傷センサー、そして種々のRNAヘリケース等のノックダウン細胞を構築した。
４．ウイルス蛋白質発現、機能および構造の解析：カプシド蛋白を標的とした抗HBV薬の同定と開発を目的として， in silicoスクリーニングアッセイを実施し，選択的な抗HBV効果を示すリード化合物を同定した。無細胞系を用いて逆転写酵素タンパク質の可溶化に成功した。HBx、HBcおよびRTタンパク質をコムギ無細胞系により大量合成し、各タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製した。RNase H阻害剤スクリーニング系を開発した。また、試験管内逆転写系を開発した。
５．ウイルス粒子形成および分泌機構の解析：任意の時期に肝細胞にHBV全タンパク質を発現し、肝炎としての免疫応答を惹起する新規モデルマウス作成を進めている。F1マウスの肝組織にHBV RNAが発現誘導された。
６．HBｘ抗原の発現、機能、構造の解析： HBxタンパク質と特異的に結合するPrdx1を同定した。HBxタンパク質はNF-kBシグナル伝達系を始めとしてSRE、SRF、AP-1の各シグナル伝達系を活性化した。HBxタンパク質と相互作用する宿主因子として脱メチル化酵素であるJMJD5を同定した。JMJD5はHBxと直接結合し、HBVの粒子産生を抑制した。JMJD5はp53との相互作用が示唆されており、HBVの粒子産生にp53の関与を示す成績が得られた。
７．病原性解析、線維化、オートファジーの影響： HBV感染キメラマウスの線維化肝臓サンプルを用いてマイクロアレイ解析を行いHBV感染による遺伝子発現の変動を検証した。さらにデータからpathway解析を行い線維化に関わる推測されるsignal pathwayの抽出を行った。In vitroにおいて、オートファジーの抑制はHBV増殖を抑制し、オートファジーの促進はHBV増殖を促進した。
結論
平成25年度は多くの研究の進捗を得ることができた。実験系の樹立、抗ウイルス活性を有する候補化合物の同定、HBV複製に関与する宿主因子の同定などが進んだ。本研究により、HBV感染による肝硬変および肝臓癌という高度な医療が必要な疾患の患者数を減らすことができれば、結果的に医療費の低減に寄与し、社会の福祉に寄与することが可能となる。
公開日・更新日
公開日
2015-06-03
更新日
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