ＨＴＬＶ－１感染症の診断法の標準化と発症リスクの解明に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201318016A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ＨＴＬＶ－１感染症の診断法の標準化と発症リスクの解明に関する研究
• 課題番号: H23-新興-一般-016
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 浜口 功(国立感染症研究所 血液・安全性研究部)

研究分担者(所属機関)

• 山口一成(熊本大学発生医学研究所)
• 渡邉俊樹(東京大学大学院新領域創成科学研究科)
• 岡山昭彦(宮崎大学)
• 佐竹正博(日本赤十字社　中央血液研究所)
• 出雲周二(鹿児島大学　医歯学総合研究科)
• 鴨居功樹(東京医科歯科大学)
• 齋藤滋(富山大学大学院)
• 大隈和(国立感染症研究所　血液・安全性研究部)
• 高起良(JR大阪鉄道病院)
• 内丸薫(東京大学医科学研究所)
• 山野嘉久(聖マリアンナ医科大学)
• 魚住公治(国立病院機構鹿児島医療センター)
• 緒方正男(大分大学医学部)
• 長谷川寛雄(長崎大学附属病院検査部)
• 宇都宮與(慈愛会今村病院分院)
• 岩永正子(帝京大学大学院)
• 相良康子(日本赤十字社　九州ブロック血液センター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 30,679,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

HTLV-1検査は、2次検査のWestern Blotting検査の結果で判定保留となる場合が少なからず存在し、それらの判定保留の判定にHTLV-1核酸検査が期待されている。平成２５年度は、①標準品細胞TL-Om1について、核酸検査標準品としての特性に関する解析を進める。②標準品と参照品を多施設で測定し、標準品と参照品の測定値をもとに施設の補正値を算出する。③妊婦検診のWestern Blotting 判定保留検体に対して核酸検査を行い、核酸検出率を解析し、判定保留対策として核酸検査の有用性を検討する。また、十分に解析が行われていないHTLV-1の水平感染の実態を明らかにする。さらに、JSPFADマテリアルバンクの検体を用いたキャリアからのATLの発症リスクの検討を行う。

研究方法

１）HTLV-1核酸検査の標準化
標準品はCFSE染色したTL-Om1をPBMC (AllCells)で希釈し、測定用検体を準備した。参照品はTL-Om1およびJurkatのゲノムDNAとした。また板橋班と協力して、妊婦検診の判定保留検体の核酸検査を行った。
２）HTLV-1の水平感染についての疫学調査
日本赤十字社で行っている献血時のHTLV-1検査の結果をもとに、検査において陽転化する症例の解析を行った。平成17-18年に検査を受けた全国330万人について後ろ向きコホートの手法で平成23年12月までの約６年の観察期間中の陽転化の比率を算出した。
３）JSPFADマテリアルバンクの検体を用いた発症リスクの検討
全国の協力医療機関から提供されたJSPFADマテリアルバンクの無症候性キャリア検体2180検体の中から、ATLへの進展する症例について解析した。

結果と考察

１）HTLV-1核酸検査の標準化
a) 核酸検査標準品細胞TL-Om1の解析
プロウイルスコピー数のさらなる確度の向上を目指してFISH, digital PCRおよびQ-PCRでTL-Om1細胞中のプロウイルス量を測定した。その結果、FISH解析結果が他の独立した2法でもほぼ一致したことから高い精度でコピー数を規定できていることを確認した。また、標準品とは別にTL-Om1とJurkatのgDNAを参照品として準備した。今回標準品と参照品を同時測定し参照品を値付けしたことによって、今後は比較的準備が簡単であるTL-Om1とJurkat細胞のgDNAも利用できると期待される。
b) 施設の補正係数の測定（多施設共同研究）
標準品（TL-Om1/PBMC希釈系列）および参照品（TL-Om1/Jurkat希釈系列）を各施設の方法に従い、HTLV-1のコピー数を測定し、標準品の理論値からの隔たりについて平行線定量法で測定した。算出された値を各施設の補正係数とし、参照品の測定値を補正することにより参照品の値付けを行った。各施設の補正係数は、前回の標準品測定の補正値から全体として大きな変化は認められなかった。
c) 妊婦WB判定保留検体の核酸検査
板橋班との協力で収集された妊婦WB判定保留検体でHTLV-1核酸検査を行ったところ、63検体中12検体（約20%）で核酸陽性となった。また陰性検体についても同様に多プライマーで測定したところ、すべて陰性となった。
２）HTLV-1の水平感染についての疫学調査
日本赤十字社で行っている献血時のHTLV-1検査の結果をもとに、検査において陽転化する症例の解析を行った。平成17-18年に検査を受けた全国330万人について後ろ向きコホートの手法で平成23年12月までの約６年の観察期間中の陽転化の比率を算出した。この結果、全国で年間に3000-4000人にHTLV-1の水平感染の発生が示唆された。水平感染の実態調査をさらに進め、キャリア再生産の根絶に繋げる方策の検討が必要である。
３）JSPFADマテリアルバンクの検体を用いた発症リスクの検討
平成25年度までにJSPFADマテリアルバンクの無症候性キャリア検体2180検体の中から、26例にATLへの進展が見られた。このうち、24例はウイルスコピー数が4%以上でATL発症リスクに大いに関連している事が明らかとなった。ウイルスコピー数の評価を取り入れたキャリアフォローの体制の構築が必要である。

結論

最大5倍とされたHTLV-1コピー数測定の施設間差は、標準品や参照品を用いることで縮小することができた。また、妊婦WB判定保留検体の約20％で核酸検査陽性となったことから、核酸検査の追加実施は有効であると考えられる。また、献血血液を用いた疫学調査の結果、全国で年間に3000-4000人にHTLV-1の水平感染の発生が示唆された。水平感染の実態調査をさらに進め、キャリア再生産の根絶に繋げる方策の検討が必要である。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-03-31
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201318016B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ＨＴＬＶ－１感染症の診断法の標準化と発症リスクの解明に関する研究
• 課題番号: H23-新興-一般-016
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 浜口 功(国立感染症研究所 血液・安全性研究部)

研究分担者(所属機関)

• 山口一成(熊本大学　発生医学研究所)
• 渡邉俊樹(東京大学大学院新領域創成科学研究科)
• 岡山昭彦(宮崎大学)
• 佐竹正博(日本赤十字社　中央血液研究所)
• 出雲周二(鹿児島大学　医歯学総合研究科)
• 鴨居功樹(東京医科歯科大学)
• 齋藤滋(富山大学大学院　医学薬学研究部)
• 大隈和(国立感染症研究所　血液・安全性研究部)
• 高起良(JR大阪鉄道病院)
• 内丸薫(東京大学医科学研究所)
• 山野嘉久(聖マリアンナ医科大学　難病治療研究センター)
• 魚住公治(国立病院機構鹿児島医療センター)
• 緒方正男(大分大学医学部)
• 長谷川寛雄(長崎大学附属病院検査部)
• 宇都宮與(慈愛会今村病院分院)
• 岩永正子(帝京大学大学院)
• 相良康子(日本赤十字社　九州ブロック血液センター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

(1) PCRによるHTLV-1核酸検査を新たに標準化し、感染の確認が正確かつ迅速に行われることを目指す。
(2) HTLV-1関連疾患の発症危険因子とされるHTLV-1ウイルス量を正確に測定できることにより、予後の予測が可能かを検討する。
(3) 標準化した検査法により、JSPFADや日本赤十字社の献血血液を活用し、HTLV-1感染の実態調査を疫学的解析により明らかにする。

研究方法

１）HTLV-1核酸検査の標準化
標準品はCFSE染色したTL-Om1をPBMCで希釈し、測定用検体を準備した。参照品はTL-Om1およびJurkatのゲノムDNAとした。また板橋班と協力して、妊婦検診の判定保留検体の核酸検査を国立感染症研究所、東京大学医科学研究所、聖マリアンナ医科大学、長崎大学病院、宮崎大学病院、鹿児島大学、日本赤十字社、SRLで行った。
２）HTLV-1の水平感染についての疫学調査
日本赤十字社で行っている献血時のHTLV-1検査の結果をもとに、検査において陽転化する症例の解析を行った。平成17-18年に検査を受けた全国330万人について後ろ向きコホートの手法で平成23年12月までの約６年の観察期間中の陽転化の比率を算出した。
３）JSPFADマテリアルバンクの検体を用いた発症リスクの検討
全国の協力医療機関から提供されたJSPFADマテリアルバンクの無症候性キャリア検体2180検体の中から、ATLへの進展する症例について解析した。

結果と考察

1) 標準品候補品の選定と国際標準化の取り組み
各施設でのウイルスコピー数の測定値のばらつきをなくし、正確な値を得るために、標準品の設定について検討した。ウイルスコピー数の測定値の安定性、ばらつき等を検討した結果、HTLV-1感染細胞株（TL-Om1）をPBMCで希釈した候補品を選定し作製した。平成25年度までに標準品を用いる測定技術を各施設においてそれぞれ確立し、国内標準化を完了した。本標準品の成果は標準化を議論するSoGAT国際会議で発表予定である。
2) 体外診断薬の開発支援
早期の保険適用を目指すために、協力研究者と本研究班の標準化された測定方法を採用した新規のHTLV-1核酸検査に関する体外診断薬開発に着手し開発を進めている。研究班は迅速な開発が遂行できるよう、研究結果を開示し開発の支援を行った。
3) 早期の保険適用を目指した先進医療によるHTLV-1検査法の実施
早期の保険適用を目指し、本検査法を大学病院検査科で実施することを推進した。これまでに熊本大学が先進医療の申請作業を行っており、本研究班で標準化されたHTLV-1核酸検査法の技術移転を行った。医療施設での実用化をさらに推進に繋がる。
4) JSPFADマテリアルバンクの検体を用いた発症リスクの検討
平成25年度までにJSPFADマテリアルバンクの無症候性キャリア検体2180検体の中から、26例にATLへの進展が見られた。このうち、24例はウイルスコピー数が4%以上でATL発症リスクに大いに関連している事が明らかとなった。ウイルスコピー数の評価を取り入れたキャリアフォローの体制の構築が必要である。
5) 水平感染によるキャリアの発生の実態調査の検討と実施
HTLV-1感染において水平感染の実態は明らかにされていない。日本赤十字社で行っている献血時のHTLV-1検査の結果をもとに、検査において陽転化する症例の解析を行った。平成17-18年に検査を受けた全国330万人について後ろ向きコホートの手法で平成23年12月までの約６年の観察期間中の陽転化の比率を算出した。この結果、全国で年間に3000-4000人にHTLV-1の水平感染の発生が示唆された。水平感染の実態調査をさらに進め、キャリア再生産の根絶に繋げる方策の検討が必要である。

結論

1) HTLV-1核酸検査法の標準化を確立した。このにより、妊婦スクリーニングをはじめHTLV-1感染の総合的な対策に役立つ。
2) JSPFADマテリアルバンクの無症候性キャリア検体の中から、ATLへの進展が見られ、そのほとんどの症例でウイルスコピー数が4%以上でATL発症リスクに大いに関連している事が明らかとなった。本研究で得られた技術に基づいたウイルスコピー数の評価を取り入れたキャリアフォローの体制の構築が必要である。
3) 水平感染によるキャリアの発生の実態調査により、国内で年間3000-4000人の水平感染によるキャリアが発生している事が示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-03-31
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201318016C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 研究班の8施設で標準品およびHTLV-1陽性臨床検体の共同測定を実施し、データの集約および解析を行った。標準品測定結果から算出した各施設の補正係数で臨床検体の測定結果を補正したところ、測定値の一致度が上昇した。正確なウイルスコピー数測定が可能となった。また、通常の10倍量のDNAを検体として用いることにより、抗体検査による判定保留例を正確に診断できる技術の国内標準化を完了した。
• 臨床的観点からの成果: 日本赤十字社で行っている献血時のHTLV-1検査において陽転化する症例の解析を行った。平成17-18年に検査を受けた全国330万人について後ろ向きコホートの手法で約６年の観察期間中の陽転化の比率を算出した。この結果、全国で年間に3000-4000人にHTLV-1の水平感染の発生が示唆された。水平感染の実態調査をさらに進め、キャリア再生産の根絶に繋げる方策の検討のための貴重なデータとなった。
• ガイドライン等の開発: 標準化された核酸検査の早期の保険適用を目指し、先進医療による検査実施の拡大と体外診断薬開発への支援が必要であり、研究班で対応した。またデータの一部を第１０回HTLV-1協議会（平成２８年7月８日）で報告した。さらにHTLV-1感染の正確な診断のための最適な検査手順に関するガイドラインの作成が急務との判断から、「妊産婦診療におけるHTLV-1感染(症)の診断指針」をまとめた。
• その他行政的観点からの成果: 本研究班の成果をもとに、判定保留例にHTLV-1核酸検査法を行うことにより判定保留例への対応が可能となり、妊婦スクリーニングをはじめHTLV-1感染の総合的な対策に役立つ。本研究成果に基づき、平成２８年４月に妊婦の判定保留例に対する核酸試験の保険適用が開始された。また、HTLV-1関連疾患の発症危険因子とされるHTLV-1ウイルス量を正確に測定できることにより、ATL発症等の予後の予測に役立つと考えられる。
• その他のインパクト: 世界に先駆けてHTLV-1ウイルス量測定技術を標準化し、正確なウイルスコピー数測定を可能となった。とくに、HTLV-1感染細胞株（TL-Om1）をPBMCで希釈した候補品を選定し作製できた事は非常に重要であり、2015.5 SoGAT国際会議で研究成果を発表した。また水平感染に関する研究結果は2014年3月19日のYOMIURI ONLINEで報道された。

発表件数

• 原著論文（和文）: 30件
• 原著論文（英文等）: 74件
• その他論文(和文): 5件
• その他論文(英文等): 3件
• 学会発表(国内学会): 78件
• 学会発表(国際学会等): 24件
• その他成果(特許の出願): 1件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 29件

特許

• 特許の名称: HTLV-1プロウイルス検出のためのプライマーセット、及びそれを用いた検出方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願２０１３－１９６２４７ ; 発明者名: 倉光球、浜口功、大隈和 ; 出願年月日: 20130920

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Takamori A Hasegawa A Utsunomiya A et al; Functional impairment of Tax-specific but not cytomegalovirus-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes in a minor population of asymptomatic human T-cell leukemia virus type 1-carriers.; Retrovirology , 8 (100) , 1-15 (2011)
• 原著論文2: Yamagishi M Nakano K Miyake A et al; Polycomb-Mediated Loss of miR-31 Activates NIK-Dependent NF-kB Pathway in Adult T Cell Leukemia and Other Cancers.; Cancer Cell , 21 , 121-135 (2012)
• 原著論文3: Nishikawa H Maeda Y Ishida T et al; Cancer/testis antigens are novel targets of immunotherapy for adult T cell leukemia/lymphoma.; Blood , 119 (13) , 3097-3104 (2012)
• 原著論文4: Iwanaga M Watanabe T Yamaguchi K ; Adult T-cell leukemia: a review of epidemiological evidence.; Front Microbiol , 3 , 322-322 (2012)
• 原著論文5: Ishihara K Sasaki D Tsuruda K et al; Impact of miR-155 and miR-126 as novel biomarkerson the assessment of disease progression and prognosis in adult T-cell leukemia.; Cancer Epidemiol , 36 , 560-565 (2012)
• 原著論文6: Asanuma S Yamagishi M Kawanami K et al; Adult T-cell leukemia cells are characterized by abnormalities of Helios expression that promote T-cell growth.; Cancer Sci , 104 (8) , 1097-1106 (2012)
• 原著論文7: Ishihara M Araya N Sato T et al; Preapoptotic protease calpain-2 is frequently suppressed in adult T-cell leukemia. ; Blood , 121 (21) , 4340-4347 (2013)
• 原著論文8: Tamai Y Hasegawa A Takamori A et al; Potential contribution of a novel Tax epitope-specific CD4+ T cells to graft-versus-Tax effect in adult T cell leukemia patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.; J Immunol , 190 , 4382-4392 (2013)
• 原著論文9: Matsubara F Sagara Y Kato Y et al; Detection of Antibodies to Human T-Cell Leukemia Virus Types 1 and 2 in Breast Milk from East Asian Women.; Biol Pharm Bull , 37 (2) , 311-314 (2014)
• 原著論文10: Kuramitsu M, Okuma K, Yamagishi M. et al; Identification of TL-Om1, an Adult T-Cell Leukemia (ATL) Cell Line, as Reference Material for Quantitative PCR for Human T-Lymphotropic Virus 1.; J. Clin. Microbiol. , 53 , 587-596 (2015)
• 原著論文11: Hiyoshi M, Okuma K, Tateyama S, et al; Furin-dependent CCL17-fused recombinant toxin controls HTLV-1 infection by targeting and eliminating infected CCR4-expressing cells in vitro and in vivo; Retrovirology , 12 (2015)
• 原著論文12: Kuramitsu M, Okuma K, Yamochi T, et al; Standardization of quantitative PCR for human T-cell leukemia virus type 1 in Japan: A collaborative study; J. Clin. Microbiol. , 53 , 3485-3491 (2015)
• 原著論文13: Tezuka K, Okuma K, Kuramitsu M, et al; Control of HTLV-1 Infection by Eliminating Envelope Protein-Positive Cells with Recombinant Vesicular Stomatitis Viruses Encoding HTLV-1 Primary Receptor; J Virol , 92 (4) , e01885- (2018)
• 原著論文14: Kuramitsu M, Sekizuka T, Yamochi T, et al; Proviral features of human T cell leukemia virus type 1 in carriers with indeterminate western blot results; J. Clin. Microbiol. , 55 (9) , 2838-2849 (2017)

公開日・更新日

• 公開日: 2014-04-23
• 更新日: 2018-06-07

収支報告書

• 文献番号: 201318016Z