文献情報
文献番号
201313048A
報告書区分
総括
研究課題名
悪性中皮腫の増殖、分化に係る細胞特性に基づく新規治療法の開発
課題番号
H24-３次がん-一般-007
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
関戸 好孝(愛知県がんセンター研究所 分子腫瘍学部)
研究分担者(所属機関)
- 中西 速夫(愛知県がんセンター研究所 腫瘍病理学部)
- 稲垣 昌樹(愛知県がんセンター研究所 発がん制御研究部)
- 瀬戸 加大(愛知県がんセンター研究所 遺伝子医療研究部)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
13,385,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
悪性中皮腫において高頻度に不活性化しているNF2-Hippo細胞内シグナル伝達系についてその原因となる分子異常を明らかにし、中皮腫に対する新たな治療戦略を構築するための知見を得ることを目的とする。さらに本シグナル伝達経路の不活性化によって恒常的活性化が引き起こされているがん遺伝子産物YAPを制御する新規戦略を見出すことを目的とする。
昨年度樹立した不死化正常中皮細胞株を用い、サイトカイン刺激等により上皮間葉移行（EMT）が誘導されるか否かを検討し、中皮腫の病理組織型の多様性の本体を明らかにする。さらに、悪性中皮腫に関わるがん関連遺伝子を導入またはノックダウンし、増殖様式や形態変化を検討すると共に、マウスへの移植実験により造腫瘍性を明らかにする。これらの実験により悪性中皮腫の腫瘍化に関わる分子機構を解明することを目的とする。
昨年度樹立した不死化正常中皮細胞株を用い、サイトカイン刺激等により上皮間葉移行（EMT）が誘導されるか否かを検討し、中皮腫の病理組織型の多様性の本体を明らかにする。さらに、悪性中皮腫に関わるがん関連遺伝子を導入またはノックダウンし、増殖様式や形態変化を検討すると共に、マウスへの移植実験により造腫瘍性を明らかにする。これらの実験により悪性中皮腫の腫瘍化に関わる分子機構を解明することを目的とする。
研究方法
当センターで樹立に成功した細胞株18株を含む、悪性中皮腫細胞株24株を使用して解析を行った。培養細胞よりRNAおよびセルライセートを抽出し発現解析を行った。ウエスタンブロット法、 RT-PCR法にて発現レベルの解析を検討した。一方、RNA干渉法を用いて遺伝子のノックダウンを行った。
昨年度樹立した不死化正常中皮細胞HOMC-B1株(上皮型)、HOMC-D4株(中間型)、およびHOMC-A4 (肉腫型)を用いた。ヒトTGF-β、IL-1β、TNF-α、及びそれらの併用により刺激しEMT誘導の有無を検討した。野生型YAP1もしくは活性型YAP1 (S127A)を導入した正常中皮細胞をヌードマウスへ皮下移植し、造腫瘍能を検討した。
昨年度樹立した不死化正常中皮細胞HOMC-B1株(上皮型)、HOMC-D4株(中間型)、およびHOMC-A4 (肉腫型)を用いた。ヒトTGF-β、IL-1β、TNF-α、及びそれらの併用により刺激しEMT誘導の有無を検討した。野生型YAP1もしくは活性型YAP1 (S127A)を導入した正常中皮細胞をヌードマウスへ皮下移植し、造腫瘍能を検討した。
結果と考察
Ajuba遺伝子ファミリーの他のメンバーであるLIMD1およびWTIP1に関して検討を進めた。AjubaのノックダウンはYAPを活性化（低リン酸化）する一方、LIMD1あるいはWTIP1のノックダウンはYAPを不活性化（高リン酸化）した。YAPの下流遺伝子であるサイクリンD1 および結合組織成長因子（CTGF）の遺伝子発現もAjubaは転写亢進、LIMD1およびWTIP1は転写抑制した。これらの結果は、Ajubaが悪性中皮腫細胞に対して腫瘍抑制性に機能する一方、LIMD1およびWTIP1は逆にAjuba機能を抑制する方向に機能することを示唆した。
不死化正常中皮細胞株を用い、サイトカイン刺激により中皮細胞の上皮間葉移行(EMT)について検討した。その結果、中間型D4株ではTGF-βなどの刺激によりEMTを誘導可能であることが明らかとなった。一方、D4細胞株のCTGF発現をsiRNAでノックダウンしたところ、敷石状の上皮細胞様配列の促進が認められた。このように、正常の中皮細胞では炎症性サイトカインによりEMTが誘導されること、またこのEMT誘導にはTGF-β/CTGF経路が関与し、この経路をブロックすることにより正常中皮のEMTの抑制のみならず、中皮腫細胞の肉腫型への悪性進展を抑制できる可能性が明らかとなった。
不死化正常中皮細胞株3株にYAPに代わり各種の細胞周期を促進する関連遺伝子の導入を行いその効果を検討した。しかし、YAPに比べ、細胞周期関連遺伝子の単独の導入では不死化正常中皮細胞の増殖能・造腫瘍能の亢進には不十分であった。
不死化正常中皮細胞株を用い、サイトカイン刺激により中皮細胞の上皮間葉移行(EMT)について検討した。その結果、中間型D4株ではTGF-βなどの刺激によりEMTを誘導可能であることが明らかとなった。一方、D4細胞株のCTGF発現をsiRNAでノックダウンしたところ、敷石状の上皮細胞様配列の促進が認められた。このように、正常の中皮細胞では炎症性サイトカインによりEMTが誘導されること、またこのEMT誘導にはTGF-β/CTGF経路が関与し、この経路をブロックすることにより正常中皮のEMTの抑制のみならず、中皮腫細胞の肉腫型への悪性進展を抑制できる可能性が明らかとなった。
不死化正常中皮細胞株3株にYAPに代わり各種の細胞周期を促進する関連遺伝子の導入を行いその効果を検討した。しかし、YAPに比べ、細胞周期関連遺伝子の単独の導入では不死化正常中皮細胞の増殖能・造腫瘍能の亢進には不十分であった。
結論
悪性中皮腫細胞においてNF2-Hippoシグナル伝達系の高頻度の不活性化が認められる。その経路においてLIM-ドメイン蛋白であるAjubaが腫瘍抑制性に機能する一方、ファミリー分子であるLIMD1、WTIP１は腫瘍促進性に機能することが示唆された。悪性中皮腫におけるYAPがん遺伝子の恒常的活性化は上流の分子の様々な不活性化異常が原因と考えられるが、本研究によりAjubaファミリーを制御することが中皮腫に対する新たな分子治療戦略となり得ることが強く示唆された。
正常不死化中皮細胞を用いてTGF-βなどのサイトカインの作用によりEMTが誘導されることを明らかにした。またこのEMT誘導にはTGF-β/CTGF経路が関与し、この経路をブロックすることにより肉腫型への悪性進展を抑制できる可能性を明らかにした。今後、これらのモデルを組み合わせることにより、中皮腫の組織多様性やEMTのメカニズム解明、また中皮腫の各組織型に対する新しい治療法の開発につなげるべくモデルをさらに発展させることが重要と考えられた。
正常中皮細胞に対して遺伝子導入をすることによりin vivoにおける造腫瘍能を付与するにはE6/E7-hTERT に加えYAP1の機能が必須であることが明らかとなった。特に、サイクリンD1等の細胞周期を促進する遺伝子の単独導入では造腫瘍能の賦与には極めて不十分であり、YAP1の機能が重要であることが明らかとなった。
正常不死化中皮細胞を用いてTGF-βなどのサイトカインの作用によりEMTが誘導されることを明らかにした。またこのEMT誘導にはTGF-β/CTGF経路が関与し、この経路をブロックすることにより肉腫型への悪性進展を抑制できる可能性を明らかにした。今後、これらのモデルを組み合わせることにより、中皮腫の組織多様性やEMTのメカニズム解明、また中皮腫の各組織型に対する新しい治療法の開発につなげるべくモデルをさらに発展させることが重要と考えられた。
正常中皮細胞に対して遺伝子導入をすることによりin vivoにおける造腫瘍能を付与するにはE6/E7-hTERT に加えYAP1の機能が必須であることが明らかとなった。特に、サイクリンD1等の細胞周期を促進する遺伝子の単独導入では造腫瘍能の賦与には極めて不十分であり、YAP1の機能が重要であることが明らかとなった。
公開日・更新日
公開日
2015-09-02
更新日
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