がん特異的細胞性免疫の活性化を基盤とする新たな治療の開発

文献情報

• 文献番号: 201313019A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: がん特異的細胞性免疫の活性化を基盤とする新たな治療の開発
• 課題番号: H22-３次がん-一般-029
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 葛島 清隆(愛知県がんセンター研究所 腫瘍免疫学部)

研究分担者(所属機関)

• 赤塚　美樹(藤田保健衛生大学　血液内科)
• 神田　輝(愛知県がんセンター研究所　腫瘍ウイルス学部 )
• 藤田　貢(愛知県がんセンター研究所　腫瘍免疫学部 )

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 10,334,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

１）免疫逃避したがん細胞が提示する新規腫瘍抗原の同定、２）マイナー組織適合抗原特異的CTLの解析と臨床応用、３）WT1発現リンパ芽球様細胞株(LCL)の抗原提示細胞としての有用性の検証および４）肺がん転移性脳腫瘍発症における骨髄由来抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)の役割と治療標的の同定について実施した。１）HLA-A24拘束性にがん細胞を認識するCTLクローンD12の標的抗原を同定することを目的とした。２）HLA-A2/HA1を認識するchimeric antigen receptor(CAR)を導入したT細胞の機能を検討することを目的とした。３）改良型bacterial artificial chromosome(BAC)クローンの分子基盤を明らかにすることを目的とした。４）肺がん転移性脳腫瘍発症におけるMDSCの役割を検討することを目的とした。

研究方法

１）HLA-A24を導入したHEK293T細胞にK562細胞のmRNAから作製したcDNAライブラリーのプラスミドを導入しD12と混合培養した。上清中にD12から分泌されたIFNγをELISA法で測定した。短縮遺伝子と合成ペプチドを用いてエピトープを同定した。２）HLA-A2/HA1テトラマーで免疫したマウス脾細胞のmRNAを用いて、ファージdisplayライブラリーを作製し、HLA-A2/HA1に特異的な単鎖抗体遺伝子を単離した。これにCD28とCD3の細胞内ドメインの一部を結合しレトロウイルスベクターを用いてT細胞に導入した。標的細胞への反応性を細胞傷害実験とサイトカインELISA法で測定した。３）B95-8株EBウイルスで欠失しているBART領域をAkata株ゲノム断片で修復した。BAC導入細胞の遺伝子発現をマイクロアレイで解析した。ターゲット検索プログラムから予測された結果と照合して候補遺伝子を選択した。４）マウス肺がん脳転移モデルにアスピリンを投与して生存率および腫瘍生着率などを観察した。肺がん既往がある脳腫瘍患者末梢血CD14+細胞の遺伝子発現をマイクロアレイで解析した。

結果と考察

１）D12が認識する遺伝子としてHSP90AB1を同定しエピトープを決定した。D12は正常細胞は認識しなかったが、siRNAによってtransporters associated with antigen processing(TAP)を抑制した癌細胞株を認識した。免疫圧力を受けたがん細胞ではTAPが失われることがある。本エピトープは正常細胞では提示されないので免疫療法の標的となり得る可能性がある。２）異なる親和性を持つ２種のCARをそれぞれ導入したT細胞は、検出限界ペプチド濃度において差を認めなかった。これまで親和性が低いとして断念していた抗体や、抗原量が少ない腫瘍もCAR-T療法の対象とできる可能性が示唆された。３）BART領域補填BAC導入細胞において、BARTマイクロRNA群の高発現とWnt抑制因子をコードする遺伝子の発現抑制を認めた。結果的にWnt経路が活性化されることになる。こうしたシグナル伝達経路の活性化が、効率の良い組換えウイルス産生に貢献する可能性が示された。４）アスピリン投与マウスにおいて、生存率上昇、脳腫瘍生着率とMDSCの腫瘍内集積の著明な低下を認めた。肺がん転移性脳腫瘍患者では健常人と比べて末梢血中のMDSC増加がみられ、そこではCD276の発現が上昇していた。転移性脳腫瘍の発症初期にMDSCが組織内に集積し、腫瘍に有利な微小環境を形成していること、および共刺激分子CD276がMDSCの免疫抑制機能に関わっていることが示唆された。

結論

１）TAP欠損細胞表面のHLA-A24分子によって提示されるHSP90βに由来するCTLエピトープをcDNA発現クローニング法によって同定した。免疫逃避した後のがん細胞のみに提示されると推察されるため新しい免疫療法の標的となり得る可能性がある。２）HLAに結合したマイナー抗原ペプチドを認識するTCR様抗体とCAR-Tを作製し、その機能および抗体の親和性や抗原量との関係、エフェクター機能について詳細に解析し、TCR様抗体を組み込んだCAR-TがHLA/ペプチド複合体を認識することを示した。今後は実際の抗腫瘍効果やoff-target効果の有無を検討し、臨床応用が可能か評価する。３）EBウイルスマイクロRNAによって一部の細胞性遺伝子の発現が制御を受けていた。組換えEBウイルスを用いて作製するLCLのさらなる改良に資する結果と考えられた。４）転移性脳腫瘍制御のために、CD276を標的分子とするMDSC除去を軸にした新規治療・予防の可能性が示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-02
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201313019B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: がん特異的細胞性免疫の活性化を基盤とする新たな治療の開発
• 課題番号: H22-３次がん-一般-029
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 葛島 清隆(愛知県がんセンター研究所 腫瘍免疫学部)

研究分担者(所属機関)

• 赤塚　美樹(藤田保健衛生大学　血液内科)
• 神田　輝(愛知県がんセンター研究所　腫瘍ウイルス学部 )
• 藤田　貢(愛知県がんセンター研究所　腫瘍免疫学部 )
• 岡村　文子（出町　文子）(愛知県がんセンター研究所　腫瘍免疫学部 )

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

１）人工抗原提示細胞を使った新規腫瘍抗原の同定、２）マイナー組織適合抗原特異的CTLの解析と臨床応用、３）WT1発現リンパ芽球様細胞株(LCL)の抗原提示細胞としての有用性の検証および４）肺がん転移性脳腫瘍発症における骨髄由来抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)の役割と治療標的の同定について実施した。１）HLA-A24拘束性にがん細胞を認識するCTLクローン16F3、D12およびD2の標的抗原を同定することを目的とした。２）マイナー抗原エピトープを用いたペプチドワクチン臨床試験を実施し、安全性と免疫誘導能を検討した。HLA-A2/HA1を認識するchimeric antigen receptor(CAR)を導入したT細胞(CRT-T)の機能を検討することを目的とした。３）組換えEBV産生の技術を応用して、がん抗原WT1を発現するLCL(WT1-LCL)を樹立し、その抗原提示細胞としての有用性を検証した。４）肺がん転移性脳腫瘍発症におけMDSCの役割を検討することを目的とした。

研究方法

１）HLA-A24導入K562細胞またはHLAを改変したTOV21G細胞を用いてCTLを誘導した。K562またはTOV21G細胞のmRNAから作製したcDNAライブラリーのプラスミドを、HLA-A24発現HEK293T細胞に導入し各CTLクローンと混合培養した。上清中に分泌されたIFNγをELISA法で測定した。短縮遺伝子と合成ペプチドを用いてエピトープを同定した。２）マイナー抗原ワクチン臨床試験では計8例に接種した。HLA-A2/HA1テトラマーで免疫したマウス脾細胞のmRNAを用いて、ファージdisplayライブラリーを作製し、HLA-A2/HA1に特異的な単鎖抗体遺伝子を単離した。これに細胞内シグナルドメインを融合したレトロウイルスをT細胞に導入した。標的細胞への反応性を細胞傷害実験とサイトカインELISA法で測定した。３）B95-8株EBVゲノム全長を含有する BACベクターに、大腸菌内相同組換え法によりWT1遺伝子の発現カセットを組み込んだ。４）マウス肺がん脳転移モデルにアスピリンを投与して腫瘍生着率などを観察した。肺がん既往がある脳腫瘍患者末梢血CD14+細胞の遺伝子発現をマイクロアレイで解析した。

結果と考察

１）16F3、D12およびD2が認識する遺伝子としてそれぞれpuromycin-sensitive aminopeptidase (PSA)、HSP90βおよびclaudin-1を同定しエピトープを決定した。16F3の認識するエピトープの生成は、膵がん細胞などにおいて変異K-rasが誘導するオートファジーに依存していた。D12はsiRNAによってtransporters associated with antigen processing(TAP)を抑制した癌細胞株を認識した。免疫圧力を受けたがん細胞ではTAPが失われることがある。この２個のエピトープは正常細胞では提示されないので免疫療法の標的となり得る可能性がある。siRNAによるHLA改変法は、他のがん細胞株にも応用可能である。２）マイナー抗原ワクチン臨床試験では重篤な有害事象は見られなかった。接種したマイナー抗原へのCTL反応が増強された例があった。異なる親和性を持つ２種のCAR-Tは、検出限界ペプチド濃度において差がなかった。低親和性抗体や、抗原量が少ない腫瘍もCAR-T療法の対象とできる可能性が示唆された。３）WT1-LCLはHLA-A24拘束性にWT1特異的CTLに認識された。末梢血T細胞をWT1-LCLで刺激することでWT1テトラマー陽性細胞が出現した。４）アスピリン投与マウスで脳腫瘍生着率とMDSCの腫瘍内集積が低下した。肺がん転移性脳腫瘍患者では健常人と比べて末梢血中の MDSC 増加がみられ、さらにCD276 の発現が上昇していた。転移性脳腫瘍の発生初期に MDSC が組織内に集積し、腫瘍に有利な環境を形成していることが示唆された。

結論

１）オートファジーの亢進した膵がん細胞上に提示されるPSA由来、TAP欠損細胞上に提示されるHSP90β由来のCTLエピトープを同定した。HLAを改変したがん細胞を用いてCTLを誘導する方法を確立し、claudin-1由来のCTLエピトープを同定した。２）マイナー抗原ワクチンの安全性と免疫誘導能を確認した。HLA-A2/HA1に特異的なCAR-Tを作製し、標的細胞を認識することを確認し、詳しい機能解析を行った。３）組換えEBV技術を応用して作製したWT1-LCLはCTLの誘導と免疫モニタリングに有用と考えられた。４）転移性脳腫瘍制御のために、MDSC除去による新規治療・予防の可能性が示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-02
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201313019C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 独自に開発した人工抗原提示細胞システムを利用して、がん細胞を特異的に傷害するCTLの認識エピトープを同定した。活性型K-rasが誘導するオートファジーあるいはTAP分子欠損によってこれらのエピトープが提示されていることを示した。効率の高い組換えEBウイルス作製システムを構築した。これを用いてWT1を発現する芽球様細胞(WT1-LCL)を作製した。HLA-A2/HA1に結合する単鎖抗体遺伝子をファージ提示法で単離した。これを導入したキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞は標的細胞を認識した。
• 臨床的観点からの成果: 同定した2個のエピトープは正常細胞では提示されないのでがん免疫療法の標的となり得る可能性がある。マイナー抗原ワクチンの臨床試験を行い、安全性と免疫誘導能を確認した。親和性の異なるCAR-T細胞の機能解析から、低親和性抗体や抗原量が少ない腫瘍もCAR-T細胞療法の対象になる可能性が示唆された。組換えEBウイルス技術を応用して作製したWT1-LCLはCTLの誘導と免疫モニタリングに有用と考えられた。転移性脳腫瘍に対して、骨髄由来抑制細胞除去が新規の治療・予防になる可能性が示唆された。
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: なし
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 44件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 75件
• 学会発表(国際学会等): 12件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 1件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Kondo S, Demachi-Okamura A, Hirosawa T, et al.; An HLA-modified ovarian cancer cell line induced CTL responses specific to an epitope derived from claudin-1 presented by HLA-A*24:02 molecules. ; Hum Immunol. , 74 (9) , 1103-1110 (2014); 10.1016/j.humimm.2013.06.030.
• 原著論文2: Kanda T, Horikoshi N, Murata T, et al.; Interaction between basic residues of Epstein-Barr virus EBNA1 protein and cellular chromatin mediates viral plasmid maintenance. ; J Biol Chem. , 288 (33) , 24189-24199 (2013); 10.1074/jbc.M113.491167.
• 原著論文3: Narita Y, Murata T, Ryo A, et al.; Pin1 interacts with the Epstein-Barr virus DNA polymerase catalytic subunit and regulates viral DNA replication.; J Virol. , 87 (4) , 2120-2127 (2013); 10.1128/JVI.02634-12.
• 原著論文4: Nishio N, Fujita M, Tanaka Y, et al.; Zoledronate sensitizes neuroblastoma-derived tumor-initiating cells to cytolysis mediated by human γδ T cells.; J Immunother. , 35 (8) , 598-606 (2012)
• 原著論文5: Nagai K, Ochi T, Fujiwara H, et al.; Aurora kinase A-specific T-cell receptor gene transfer redirects T lymphocytes to display effective antileukemia reactivity.; Blood , 119 (2) , 368-376 (2012); 10.1182/blood-2011-06-360354.
• 原著論文6: Demachi-Okamura A, Torikai H, Akatsuka Y, et al.; Autophagy creates a CTL epitope that mimics tumor-associated antigens. ; PLoS One , 7 (10) , e47126- (2012); 10.1371/journal.pone.0047126.
• 原著論文7: Yamamura T, Hikita J, Bleakley M, et al.; HapMap SNP Scanner: an online program to mine SNPs responsible for cell phenotype.; Tissue Antigens , 80 (2) , 119-125 (2012); 10.1111/j.1399-0039.2012.01883.x.
• 原著論文8: Kanda T, Ochi T, Fujiwara H, et al.; HLA-restricted presentation of WT1 tumor antigen in B-lymphoblastoid cell lines established using a maxi-EBV system. ; Cancer Gene Ther. , 19 (8) , 566-571 (2012); 10.1038/cgt.2012.34.
• 原著論文9: Hirosawa T, Torikai H, Yanagisawa M, et al.; Mismatched HLA class II-restricted CD8+ cytotoxic T cells may serve selective GVL effects following allogeneic hematopoietic cell transplantation. ; Cancer Sci. , 102 (7) , 1281-1286 (2011); 10.1111/j.1349-7006.2011.01949.x.
• 原著論文10: Ochi T, Fujiwara H, Okamoto S, et al.; Novel adoptive T-cell immunotherapy using a WT1-specific TCR vector encoding silencers for endogenous TCRs shows marked antileukemia reactivity and safety.; Blood , 118 (6) , 1495-1503 (2011); 10.1182/blood-2011-02-337089.
• 原著論文11: Kitawaki T, Kadowaki N, Fukunaga K, et al.; A phase I/IIa clinical trial of immunotherapy for elderly patients with acute myeloid leukemia using dendritic cells co-pulsed with WT1 peptide and zoledronate. ; Brit J Haematol. , 153 (6) , 796-799 (2011); 10.1111/j.1365-2141.2010.08490.x.
• 原著論文12: Kitawaki T, Kadowaki N, Fukunaga K, et al.; Cross-priming of CD8(+) T cells in vivo by dendritic cells pulsed with autologous apoptotic leukemic cells in immunotherapy for elderly patients with acute myeloid leukemia.; Exp Hematol. , 39 (4) , 424-433 (2011); 10.1016/j.exphem.2011.01.001.

公開日・更新日

• 公開日: 2015-04-28
• 更新日: 2018-06-06

収支報告書

• 文献番号: 201313019Z