グロメルロイド血管制御ナノｓｉＲＮＡによる膠芽腫の革新的治療戦略開発

文献情報

• 文献番号: 201308026A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: グロメルロイド血管制御ナノｓｉＲＮＡによる膠芽腫の革新的治療戦略開発
• 課題番号: H24-医療機器-若手-010
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 狩野 光伸 (岡山大学 大学院医歯薬学総合研究科)

研究分担者(所属機関)

• 岸村　顕広(九州大学　大学院工学系研究科)
• 松崎　典弥(大阪大学　大学院工学研究科)
• 西原　広史(北海道大学　大学院医学研究科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 医療機器開発推進研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 4,500,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

我々はこれまでの研究から、グロメルロイド血管（GV）では血管内皮細胞周囲の壁細胞（PC）集積が豊富であることを見出しており、これによりPCの過剰増殖が血管バリア能を異常に強化している可能性を仮説とした。この仮説に基づき、本研究では膠芽腫組織内におけるPCを抑制することでGV形成を回避しうる可能性を考えた。GVは、悪性膠芽腫における特徴的血管構造である。しかし、その機能的側面にはほとんど着目されてこなかった。従って妥当な実験系も存在していない。これをヒト病理学的所見に照らしながら確立し、主にGVに含まれるPCを治療標的として、その血管内皮細胞（endothelial cells、EC）への接着や成熟を抑制するsiRNA配列を特定し、そのsiRNAを搭載したナノDDSをヒトにおける適用可能性を視野に入れつつ開発した。

研究方法

脳腫瘍モデル細胞マウス移植モデルにおけるGV様構造の解析を行った。本研究では、siRNA製剤の薬効を病理組織構築と比較をしつつ、十分に検証する必要があった。そこでより迅速な解析を行うために、TS-GFP細胞による皮下移植モデルの組織構築について解析を行った。CXCL12およびその受容体であるCXCR4について解析を進めた。CXCR4を阻害する低分子化合物を移植モデルに投与し、PC被覆およびナノ粒子分布に関して組織学的に解析した。CXCL12を抑制するsiRNA配列（siCXCL12）を決定した上で、siRNA送達用ナノデバイスであるcRGD付加PEG-イミノチオラン修飾ポリリシンによるミセルに搭載し（以下、siCXCL12ミセル）、同様にPC被覆並びにPICsome分布を評価した。倫理面への配慮を行った。

結果と考察

脳腫瘍モデル細胞を移植する際に調製する細胞懸濁液の至適条件について検討を行い、マウスに移植した。組織学的評価の結果、皮下腫瘍組織内の血管もSMA陽性細胞による被覆が顕著に見られ、血管密度が高く、形状も不整であった。この結果より、皮下移植モデルを用いることでより迅速にGV内PC抑制による薬効評価を行うことが可能であると考え、初期検討において皮下移植モデルを利用することとした。CXCR4阻害剤を、腹腔内投与すると、PC（SMA陽性細胞）による血管の被覆が約50%低下し、PICsomeの腫瘍内分布領域が有意に拡大することが明らかになった。siCXCL12をcRGD付加PEG-イミノチオラン修飾ポリリシンによるミセルに搭載し、同様にPC被覆並びにCy5-PICsome分布を評価した。PC被覆血管の有意な減少が確認でき、PICsome分布領域が拡大することを確認した。以上の結果より、TS-GFP細胞による膠芽腫モデルにおいてCXCL12を特異的に抑制するsiRNAミセルを投与すれば、その後に投与するナノ薬剤の腫瘍実質への到達効率改善が示された。

結論

膠芽腫は、効果的な化学療法の開発が待たれる疾患である。本研究では膠芽腫の特徴的病理構造、特にGVに着目し、ナノ製剤技術の応用で膠芽腫の新規治療戦略確立を目指した。GV構成細胞を抑制するシグナル分子の同定について、GV形成の責任因子として主に老化関連分泌因子群（SASPs）に着目してきた。既存データベースを用いたin silico解析結果を合わせ、CXCL12を標的分子候補として解析を進めた。その受容体であるCXCR4のヒト病理における発現解析の結果、GV構造が主に見られるGradeIVの検体においてのみ、GV構造においてCXCR4陽性細胞が確認できた。GradeIVの検体ではGV構造周囲においても、CXCR4陽性細胞がGVに向けて集積する病理像が得られており、CXCL12-CXCR4シグナルがヒト病理においてもGV形成に関与する可能性が示唆された。新たに腫瘍細胞の三次元培養に成功し、その技術基盤を確立した。cRGD付加PEG-イミノチオラン修飾ポリリシンにsiCXCL12を内包し、動物モデルに投与した結果、siCXCL12投与群において壁細胞が強く抑制され、siCXCL12ミセル処置後に投与されるナノ薬剤の腫瘍内分布向上が明らかになった。以上、siCXCL12をナノ担体に内包して腫瘍血管を特異的に抑制し、ナノ薬剤を投与すれば、膠芽腫においても治療効果を示しうることが示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-03-11
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201308026B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: グロメルロイド血管制御ナノｓｉＲＮＡによる膠芽腫の革新的治療戦略開発
• 課題番号: H24-医療機器-若手-010
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 狩野 光伸 (岡山大学 大学院医歯薬学総合研究科)

研究分担者(所属機関)

• 岸村　顕広(九州大学　大学院工学系研究科)
• 松崎　典弥(大阪大学　大学院工学研究科)
• 西原　広史(北海道大学　大学院医学研究科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 医療機器開発推進研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

悪性膠芽腫はヒト脳腫瘍のなかでももっとも悪性度が高い腫瘍である。その特徴的病理学的所見として、異常の血管構造であるグロメルロイド血管（GV）が知られている。しかし、その機能的意義は明確ではない。他方、我々はこれまで、ナノ薬剤の薬効という観点から腫瘍血管を解析し、とりわけ難治の膵癌などにおいては、腫瘍血管構造がこれまで考えられていたよりも壁細胞(pericyte, PC)に豊かに覆われ、またナノ粒子に対する漏出性が低いことを明らかにしてきた。主にこのGVを治療標的として、PCの血管内皮細胞（endothelial cells、EC）への接着や成熟を抑制しその漏出性を高くするための制御対象分子を見出して、その分子に対するsiRNA配列を特定し、そのsiRNAを搭載したナノDDSを、ヒトにおける適用可能性を視野に入れつつ開発することを本研究の目的とした。

研究方法

GV形成機構解明を行う本研究の目的にかなう膠芽腫モデル細胞株の選定を行った。膠芽腫モデル細胞株の選定にあたっては、その細胞由来の分泌性因子が壁細胞分化を促進することを指標とした。見出した細胞を用いた膠芽腫動物モデルの作製や、GV形成を司るシグナル分子の候補特定とGV制御に最も効果的な治療標的分子群の同定を進めた。治療標的分子群としては、GV形成に対し促進的に働く腫瘍由来因子に着目し、同定を試みた。本研究では主に老化関連分泌因子群（SASPs）に着目した解析の結果、同細胞ではSASPs分子群が高く発現していることが確認された。この細胞を用いてGV形成に関する評価を行った。同所移植標本について組織学的解析を行った結果、GV様の構造はヒト同様にSMA陽性細胞が他モデルに比較し厚く血管周囲を覆っていることを見いだした。制御対象分子としては、in silico解析手法により導出し、CXCL12について検証を進めた。CXCL12の受容体であるCXCR4の低分子阻害剤移植モデルに投与し、PC被覆およびナノ粒子（PICsome, 粒径100 nm）分布に関して組織学的に解析した。CXCL12を抑制するsiRNA配列（siCXCL12）を決定した上で、cRGD付加PEG-イミノチオラン修飾ポリリシンによるミセルに内包し、（siCXCL12ミセル）、同様にPC被覆並びにPICsome分布を評価した。病理検体及び動物実験に関して倫理面への配慮を行った。

結果と考察

選定した細胞の培養上清により間葉系幹細胞におけるPCマーカーの発現上昇が認められた。同所移植組織ではGV様の構造はヒト同様にSMA陽性細胞が他モデルに比較し厚く血管周囲を覆っていることが示された。既存データベースを用いたin silico解析により、CXCL12を見出し、その受容体であるCXCR4に対する臨床認可された低分子化合物阻害剤も存在することから、検証を進めることとした。CXCR4阻害剤を移植モデルに腹腔内投与した結果、PCによる血管の被覆が約50%低下し、尾部静脈より投与したPICsomeの腫瘍内分布領域が有意に拡大した。そこでCXCL12を抑制するsiRNA配列（siCXCL12）を設計しcRGD付加PEG-イミノチオラン修飾ポリリシンによるミセルに搭載しPICsome分布を評価したところ、PICsome分布領域が拡大することを確認した。腫瘍細胞による三次元構築条件を確立した。以上より、ヒト膠芽腫においてCXCR4のGV形成への関与が示唆され、対応する動物モデルで確認されたCXCL12阻害によるナノ粒子分布増大の傾向がヒトにおいても再現可能であることが期待できると考える。

結論

膠芽腫は脳腫瘍の中で最も悪性度が高いが、現状において有効な治療法はほぼなく、治療成績は依然として悪性腫瘍の中でも特に悪く、効果的な化学療法の開発が待たれる。近年、ナノ薬剤送達システム（ナノDDS）はがん治療において有効性を示しつつあるが、膠芽腫に対しては製剤設計のみではナノDDSの十分な薬効発揮は難しい。したがって、本研究では膠芽腫の特徴的病理構造、特にグロメルロイド血管（GV）に着目し、膠芽腫の新規治療戦略確立を目指した結果、CXCL12-CXCR4シグナルがヒトにおいても動物モデルにおいてもGV形成に関与する可能性が示唆された。このためCXCL12を抑制するミセル製剤の開発を行ってその効果確認を行ったところ、siCXCL12見せる投与群において壁細胞が強く抑制され、siCXCL12ミセル処置後に投与されるナノ薬剤の腫瘍内分布が向上することが明らかになった。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-03-11
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201308026C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 膠芽腫治療に向け、我が国の先導するナノ薬剤技術を実用し治療効果を得るための第一歩となる可能性がある。
• 臨床的観点からの成果: 膠芽腫の薬物治療開発に向けた第一歩となる可能性がある。
• ガイドライン等の開発: 現時点で該当なし
• その他行政的観点からの成果: 膠芽腫の有効な薬物治療実現に向けた第一歩となる可能性がある。
• その他のインパクト: 現時点で該当なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 13件
• その他論文(和文): 2件
• その他論文(英文等): 2件
• 学会発表(国内学会): 10件
• 学会発表(国際学会等): 3件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 5件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Kano, MR; Nanotechnology and tumor microcirculation.; Adv Drug Deliv Rev. , 74 , 2-11 (2014)
• 原著論文2: Kano, MR; Nano-pathophysiology: a novel integrated approach to disease through application of nanotechnology.; Adv Drug Deliv Rev. , 74 , 1- (2014)
• 原著論文3: Miura Y, Nishihara H, Kano MR, Kataoka K et al.; Cyclic RGD-linked polymeric micelles for targeted delivery of platinum anticancer drugs to glioblastoma through the blood-brain tumor barrier.; ACS Nano. , 7 (10) , 8583-8592 (2013)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: 2015-06-16

収支報告書

• 文献番号: 201308026Z