文献情報
文献番号
201305009A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来心筋細胞を用いた薬剤性不整脈評価の薬事申請利用における妥当性の検討
課題番号
H25-特別-指定-015
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
諫田 泰成(国立医薬品食品衛生研究所 薬理部)
研究分担者(所属機関)
- 関野 祐子(国立医薬品食品衛生研究所 薬理部)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 行政政策研究分野 厚生労働科学特別研究
研究開始年度
平成25(2013)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
5,600,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
カリウムチャンネルを発現させたヒト細胞などを用いた心毒性試験は、Torsade de pointes型心室頻拍などの致死的な薬剤性不整脈の可能性を評価する重要な試験として位置づけられており、薬事申請資料の一部を構成するものである。
ヒトES/iPS細胞心筋細胞を従来の動物細胞やヒト培養細胞（カリウムチャンネル発現ヒト胎児腎細胞）に代わる安全性薬理試験系として利用しようとする動きが出てきている。しかしながら、分化心筋細胞の株間及びロット間での活動電位の波形、心電図のQT間隔、拍動数に大きなばらつきがあり、医薬品による致死的不整脈など副作用の予測に有効なのか判断する必要がある。
そこで本研究において、市販のヒトiPS細胞由来分化心筋細胞を入手して、複数の分化心筋細胞株の品質評価を行った。また、同一の分化心筋細胞を用いて、我々が整備した標準的プロトコルの再現性を評価した。
ヒトES/iPS細胞心筋細胞を従来の動物細胞やヒト培養細胞（カリウムチャンネル発現ヒト胎児腎細胞）に代わる安全性薬理試験系として利用しようとする動きが出てきている。しかしながら、分化心筋細胞の株間及びロット間での活動電位の波形、心電図のQT間隔、拍動数に大きなばらつきがあり、医薬品による致死的不整脈など副作用の予測に有効なのか判断する必要がある。
そこで本研究において、市販のヒトiPS細胞由来分化心筋細胞を入手して、複数の分化心筋細胞株の品質評価を行った。また、同一の分化心筋細胞を用いて、我々が整備した標準的プロトコルの再現性を評価した。
研究方法
複数の市販の分化心筋細胞を用いて、βアドレナリン受容体作動薬イソプレテノロールに対する反応性を株間で解析した。とくに、拍動数BPM (Beat per Minute)およびPKA活性の解析をした。
また、１社の分化心筋を用いて、我々が標準化したプロトコルに従って、多点電極のディッシュで密に播種することにより拍動が同期した心筋シートを作成した。QT間隔に相当する指標として、細胞外電位のField Potential Duration (FPD) およびEAD/TAの発生率を解析した。
また、１社の分化心筋を用いて、我々が標準化したプロトコルに従って、多点電極のディッシュで密に播種することにより拍動が同期した心筋シートを作成した。QT間隔に相当する指標として、細胞外電位のField Potential Duration (FPD) およびEAD/TAの発生率を解析した。
結果と考察
１）心筋シートの電気化学的評価
分化心筋細胞をβアドレナリン受容体作動薬イソプレテノロール（30 nM）で刺激したところ、A社の分化心筋細胞は速やかに拍動が早くなったのに対して、B社は全く影響が認められなかった。そこで、A社の分化心筋細胞を高密度培養して心筋シートを作製し多点電極システムを用いて解析した。30nMのイソプレテノロールによってBPMの増加やISIの減少が認められた。さらに、アドレナリン受容体のGs/cAMP/PKAシグナルが重要であることから、イソプレテレノール刺激により活性化されているのか検討した。その結果、A社の心筋は活性化が認められたが、B社の心筋はあまり影響が認められなかった。従って、不整脈発生に重要である交感神経刺激応答に明確な株間差が存在することが示唆された。
本研究により、市販の分化心筋細胞を使用する際にはβアドレナリン受容体の反応性およびPKA活性の重要性が明らかとなった。よって交感神経系の活性化は検討すべき項目であると考えられる。
今後、より多くの分化心筋細胞を用いてアドレナリン受容体の機能を比較することにより、分化心筋の性質の差を説明できる可能性が考えられる。
２）分化心筋細胞のバリデーション研究
今回のバリデーション研究には、iCellをモデル細胞として用いて検討を行った。iCellの品質評価のために、実験プロトコルを統一化して、エーザイ、国立衛研、東邦大学の3施設でバリデーションを行った。陽性対象物質としてhERG阻害剤E-4031を用いた。その結果、3施設すべてにおいてE-4031の添加により、濃度依存的にFPDの延長が認められた。延長の程度は10nM処理により10～20％であった。
さらに、E-4031によるEAD/TAの発生も観察された。EAD/TAの発生率に関して3施設で比較した結果、発生する濃度は10～30nMと施設間の差が認められたが、100nMにおいては3施設ともすべてのMEDプローブにおいてEAD/TAの発生率が認められた。
今回、市販の心筋で同一ロットという条件下ではあるが、3施設で同じ細胞を用いて共通のプロトコールのもとで薬理試験を実施することにより、再現性を検証することが可能になった。今後は、元のiPS細胞株や分化誘導法を比較検討することにより、分化心筋細胞の再現性・信頼性がより明らかになると期待される。
さらに、EAD/TAの発生率を指標とすることにより、QT延長とは異なる催不整脈作用を評価でき、本研究においては3施設で検証することに成功した。今後、EADやTAの判断基準を設定することにより、新規の試験法に発展することが期待される。
分化心筋細胞をβアドレナリン受容体作動薬イソプレテノロール（30 nM）で刺激したところ、A社の分化心筋細胞は速やかに拍動が早くなったのに対して、B社は全く影響が認められなかった。そこで、A社の分化心筋細胞を高密度培養して心筋シートを作製し多点電極システムを用いて解析した。30nMのイソプレテノロールによってBPMの増加やISIの減少が認められた。さらに、アドレナリン受容体のGs/cAMP/PKAシグナルが重要であることから、イソプレテレノール刺激により活性化されているのか検討した。その結果、A社の心筋は活性化が認められたが、B社の心筋はあまり影響が認められなかった。従って、不整脈発生に重要である交感神経刺激応答に明確な株間差が存在することが示唆された。
本研究により、市販の分化心筋細胞を使用する際にはβアドレナリン受容体の反応性およびPKA活性の重要性が明らかとなった。よって交感神経系の活性化は検討すべき項目であると考えられる。
今後、より多くの分化心筋細胞を用いてアドレナリン受容体の機能を比較することにより、分化心筋の性質の差を説明できる可能性が考えられる。
２）分化心筋細胞のバリデーション研究
今回のバリデーション研究には、iCellをモデル細胞として用いて検討を行った。iCellの品質評価のために、実験プロトコルを統一化して、エーザイ、国立衛研、東邦大学の3施設でバリデーションを行った。陽性対象物質としてhERG阻害剤E-4031を用いた。その結果、3施設すべてにおいてE-4031の添加により、濃度依存的にFPDの延長が認められた。延長の程度は10nM処理により10～20％であった。
さらに、E-4031によるEAD/TAの発生も観察された。EAD/TAの発生率に関して3施設で比較した結果、発生する濃度は10～30nMと施設間の差が認められたが、100nMにおいては3施設ともすべてのMEDプローブにおいてEAD/TAの発生率が認められた。
今回、市販の心筋で同一ロットという条件下ではあるが、3施設で同じ細胞を用いて共通のプロトコールのもとで薬理試験を実施することにより、再現性を検証することが可能になった。今後は、元のiPS細胞株や分化誘導法を比較検討することにより、分化心筋細胞の再現性・信頼性がより明らかになると期待される。
さらに、EAD/TAの発生率を指標とすることにより、QT延長とは異なる催不整脈作用を評価でき、本研究においては3施設で検証することに成功した。今後、EADやTAの判断基準を設定することにより、新規の試験法に発展することが期待される。
結論
本研究において、複数の市販のiPS細胞由来分化心筋細胞用いて、βアドレナリン受容体による心拍亢進が品質評価に重要であることを明らかにした。また市販のヒトiPS細胞由来分化心筋細胞を１株使用して多施設バリデーションを行い、どの施設においてもE-4031の薬理作用を検出できることを明らかにした。さらに、EAD/TAの発生率を指標とすることにより、QT延長とは異なる催不整脈作用を評価できることが明らかになった。
公開日・更新日
公開日
2015-05-28
更新日
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