microRNA阻害剤による骨肉腫がん幹細胞制御を基盤とした新たな革新的がん治療の実用化を目指す前臨床試験

文献情報

文献番号

201239013A

報告書区分

総括

研究課題名

microRNA阻害剤による骨肉腫がん幹細胞制御を基盤とした新たな革新的がん治療の実用化を目指す前臨床試験

課題番号

H24-実用化（がん）-一般-001

研究年度

平成24(2012)年度

研究代表者(所属機関)

川井　章(独立行政法人国立がん研究センター　軟骨部腫瘍科)

研究分担者(所属機関)

落谷　孝広(国立がん研究センター研究所、分子腫瘍学・再生医学（分子細胞治療研究分野）)
藤原　智洋(国立がん研究センター研究所、分子腫瘍学・再生医学（分子細胞治療研究分野）)
伊庭　英夫(東京大学医科学研究所、感染・免疫部門、宿主寄生体学分野)
伊藤　博(東京農工大学、農学部附属動物医療センター、腫瘍科)
尾崎　敏文(岡山大学大学院医歯薬学総合研究科生体機能再生・再建学講座、整形外科学)
尾崎　充彦(鳥取大学医学部、腫瘍病理学)
松田　範昭(（株）スリー・ディー・マトリックス、事業開発部（ペプチド製品開発）)

研究区分

厚生労働科学研究費補助金健康長寿社会実現のためのライフ・イノベーションプロジェクト難病・がん等の疾患分野の医療の実用化研究（がん関係研究分野）

研究開始年度

平成24(2012)年度

研究終了予定年度

平成26(2014)年度

研究費

89,344,000円

研究者交替、所属機関変更

-

研究報告書（概要版）

研究目的

がん組織内のがん幹細胞分画をいかに制御するか、様々ながん種で研究開発が進んでいる。本研究班は平成23年度までにヒト骨肉腫細胞株におけるがん幹細胞分画を単離し、その悪性形質に関与するmicroRNAとしてmiR-133aを同定した。更にLNAによるmiR-133a機能阻害により、薬剤耐性や浸潤能などのがん幹細胞分画における悪性形成の制御をin vitro、in vivoにおいて見出したが、LNA製品は海外企業が特許を獲得している為、伊庭らが開発したS-TuD (Synthetic Tough Decoy RNA)を応用し、骨肉腫悪性形質の制御を第一の目的とした。S-TuDはin vitroにおいて、同濃度のLNAよりも高い阻害活性を有することが分っているが、生体内での効果は未だ確認されておらず、大量合成方法も確立されていない。従って、構造体の大量合成方法・医薬品開発に必須の規格試験の確立を第二の目的とした。骨肉腫がん幹細胞マーカーにおける予後解析の報告並びにmiR-133a阻害による分子機構の変化の解析を第三の目的とした。

研究方法

【1】S-TuDの開発並びにS-TuD製剤のin vitroにおける有効性評価【2】S-TuD-antimiR-133aの骨肉腫に対する有効性評価（1）S-TuDのin vitroでの有効性試験;（2）S-TuDの動物腫瘍モデルでの有効性試験（2-1）腫瘍内発現の解析(2-2) Preliminary有効性実験【3】S-TuD製剤の大量合成プロトコールの確立【4】S-TuDの安全性試験計画とDDSの検討【5】イヌ骨肉腫症例に対する抗miR-133a核酸製剤投与【6】miR-133aの標的遺伝子の同定【7】多施設における骨肉腫臨床検体の収集と解析【8】骨肉腫臨床検体におけるmiR-133a及びその標的遺伝子の解析

結果と考察

【1】miR-21,miR-16,miR200cに対するMBS設計のアルゴリズムを作成し、miR-199a-3p,-5p, miR-214,miR-142-3pのS-TuD を設計し、阻害効率を評価。いずれの場合も1nM 以下で対応するmiRNAの活性を完全に抑制しうることが証明された。miR-133aに対するS-TuDも同じアルゴリズムで設計した【2】（1）S-TuDはin vitroにおいて、LNAよりも高い阻害活性を有していることがヒト骨肉腫細胞で分った（2-1）S-TuD投与群では、0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kgの全ての濃度において、miR-133aの発現が抑制されていた。24時間後の腫瘍において、1mg/kgの濃度ではS-TuDは約8割遺伝子発現を抑制、更にその効果は1週間後も持続されていた（2-2）コントロール群に比べ、S-TuD単独投与群、シスプラチン単独投与群、S-TuD・シスプラチン併用投与群において、腫瘍の増殖抑制効果が示された。miR-133aに対するS-TuDはin vivoにおいて、併用投与で高い腫瘍増殖抑制効果を示した【3】2’-O-メチル化修飾された長鎖1本鎖RNAの合成及び精製について、基本的な方法を確立し、大量生産を実施した【4】S-TuDの単回投与毒性試験・血中動態試験については、1.0～100 mg/kgの範囲で投与量を決定した。S-TuDとA6Kの複合体を調製し、マウスでの比較有効性試験の結果、S-TuDの臨床想定投与用量ではDDS無しでも効果を認めた【5】伊藤によるイヌ症例はLNA投与後、局所における腫瘍の増大が4ヶ月間認められず、肺等への遠隔転移も認められなかった【6】miRNA-Argonaute-2複合体に対する免疫沈降法から得られたcDNAの網羅的解析から、約2000種の候補遺伝子を得た。最終的に20種の遺伝子に対するsiRNAを作成し、其々の発現抑制下に機能解析を行ったところ、SGMS2、UBA2、SNX30、ANXA2が浸潤能を規定し、MAST4、DUSP11、ANXA2が薬剤抵抗性を規定することが分った【7】骨肉腫臨床サンプルを集積し、RT-PCRにより本研究に適したものであると確認した【8】CD133,miR-133の発現量が予後不良と相関し、miR-133aの標的遺伝子が予後良好と相関することが分った。

結論

本研究課題のもと、S-TuDの開発合成、大量合成方法の確立、安全性試験・in vitro試験・in vivo試験の着手、DDSの検討、骨肉腫臨床検体における解析を行った。特に、S-TuD-antimiR-133aの合成法の確立は世界初であり、創薬研究の大きな一歩であった。また、miR-133a標的遺伝子には骨肉腫の予後に関与する新たな分子が同定されており、本研究を通じて骨肉腫の新たな分子標的遺伝子が同定されたことも成果である。