文献情報
文献番号
201234050A
報告書区分
総括
研究課題名
食品添加物における遺伝毒性発がん物質の評価法に関する研究
課題番号
H24-食品-若手-018
研究年度
平成24(2012)年度
研究代表者(所属機関)
石井 雄二(国立医薬品食品衛生研究所 安全性生物試験研究センター病理部)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 食品の安全確保推進研究
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
5,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
化学物質の安全性評価において、遺伝毒性の有無は閾値の設定が可能か否かを決める重要な評価である。レポーター遺伝子導入動物を用いた変異原性試験は標的臓器における遺伝毒性を評価可能なだけでなく、同一組織における機序探索が可能である点で優れている。一方、近年、松田らによって考案されたDNAアダクトーム解析は網羅的にDNA損傷を検出できる有用なツールである。本研究では、網羅的DNA損傷解析と酸化的DNA損傷評価をレポーター遺伝子導入動物であるgpt deltaラットに応用した「網羅的DNA損傷解析とin vivo変異原性の包括試験」の構築を目的として、本年度は【実験1】網羅的DNA損傷解析法の構築、【実験2】酸化的DNA損傷評価法の確立及び【実験3】「網羅的DNA損傷解析とin vivo変異原性の包括試験」の有用性評価を実施した。
研究方法
【実験1】では、網羅的DNA損傷解析に用いるHPLCの分離条件及びMS/MSのイオン化条件を検討した。また、ESを300 mg/kgの濃度で13週間投与したラット肝臓を用いて、サンプルのDNA濃度を検討した。【実験2】では、4-hydroxy-2-nonenalから得た4-oxo-2-nonenalをdG、dA及びdCと反応させ、heptanone-etheno（Hε）付加体の分析用標準品を合成した。LC-MS/MSによる定量解析では、Hε-dG、dA及びdCをそれぞれm/z 404>288、388>272及び364>248で検出した。本測定法を用いて無処置群のラット肝臓及び腎臓から抽出したDNA中の各付加体を測定し、検出感度を確認した。【実験3】では、被験物質として遺伝毒性物質である2-amino-3-methylimidazo［4、5-f］quinoxaline（IQ）及びサフロール（SFO）と非遺伝毒性物質であるアリザリン（Alz）を選定し、雄性6週齢のgpt deltaラッに300、5000及び800 ppmの濃度で4週間混餌投与した。投与後、肝臓及び腎臓について網羅的DNA損傷解析、酸化的DNA損傷解析及びin vivo変異原性の検索を実施し、本法の有用性を検討した。
結果と考察
【実験1】最適化したLC-MS/MS条件を用いて、ES処置後のラット肝臓の網羅的DNA損傷解析を行った結果、既知のES-N2-dG、C8-dG及びdAと、新たにdCの付加体を検出することができ、そのスポットの大きさは過去に報告した定量値に比例していた。よって、本法を用いることで未知のDNA付加体の検出に加え付加体の生成量についての考察も可能と考えられた。【実験2】本実験で設定したLC-MS/MS条件下においてHε-dG、dA及びdCはそれぞれ16.0、17.0及び17.2分に検出された。対照群のラットではHε-dCが肝臓、腎臓ともに検出され、そのピーク強度から定量解析が十分可能であることから、実験動物における酸化的DNA損傷の指標として有用なマーカーになると考えられた。【実験3】DNAアダクトーム解析による網羅的DNA損傷解析ではIQ及びSFOから生じる種々のDNA付加体が検出され、MSスペクトラム解析によって得られる構造情報から付加体の構造同定または推定が可能であった。また、SFO及びAlzでは8-OHdGレベルの上昇が認められ、SFOの遺伝毒性への酸化的DNA損傷の寄与も示唆されたことから、酸化的DNA損傷評価の重要性が示された。さらに、DNA損傷のパターンと変異スペクトラムを組み合わせた考察が可能であり、各DNA付加体が有する変異ポテンシャルの特徴についても推測することが可能であった。
結論
DNAアダクトームによる網羅的DNA損傷解析を用いることで、化学物質によるDNA傷害性を正確かつ迅速に評価が可能であった。また、gpt deltaラットを用いた包括的試験法は、化学物質の変異原性の有無と、その原因となるDNA損傷を評価できることから、より詳細な化学物質の遺伝毒性評価が可能であった。今後、様々な化学物質に本法を適応しデータを蓄積することで、環境化学物質の遺伝毒性予測やそのメカニズム解明に有用なツールになると考えられた。
公開日・更新日
公開日
2013-06-24
更新日
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