非食用モダンバイオテクノロジー応用生物の食品への混入危害防止のための検知法開発に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201234001A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 非食用モダンバイオテクノロジー応用生物の食品への混入危害防止のための検知法開発に関する研究
• 課題番号: H22-食品-一般-001
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 穐山 浩(国立医薬品食品衛生研究所 食品添加物部)

研究分担者(所属機関)

• 五十君　静信(国立医薬品食品衛生研究所　食品衛生管理部)
• 小関　良宏(国立大学法人東京農工大学大学院共生科学研究院生命機能科学分野)
• 吉松　嘉代(独立行政法人医薬基盤研究所・薬用植物資源研究センター筑波研究部)
• 中島　治(国立医薬品食品衛生研究所　代謝生化学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 食品の安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 9,600,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

研究目的：非食用モダンバイオテクノロジーを応用した非食用植物・生物について食品への混入に関する安全性確保を実施するため、それらの動向の調査研究を進め、非食用モダンバイオテクノロジー応用植物・生物の食品中への混入を防止するための安全性確保に有用な検知法の開発を行うことを目的とする。

研究方法

研究方法：国内外における非食用モダンバイオテクノロジー応用植物・生物に関する開発・実用化の情報を収集し解析を行う。対象試料あるいは疑似試料に関しては入手または作製を検討する。また項目毎に非食用モダンバイオテクノロジー応用植物・生物に共通して利用される可能性の高い遺伝子の塩基配列情報を迅速に検出する手段の開発を検討し、検知法を確立する。確立された手法を混入の恐れのある試料から実態調査を行う。

結果と考察

結果と考察：リアルタイムPCR法を用いてジャガイモ加工食品中に混入する可能性のある未承認非食用遺伝子組換え（GM）ジャガイモを検知する方法を開発するため、GM表示対象のジャガイモ加工食品から抽出したジャガイモDNAの断片長の検出下限値を解析した。その結果、ジャガイモ加工食品から精製したDNAを定性PCR法に供したところ、すべての加工食品において検出可能な増幅断片長は51～101 bp以下であった。この結果から、増幅断片長を51～101 bp以下に設計することで、標的遺伝子を検出できることが示唆された。非食用バイオテクノロジーの開発状況に関するWeb公開用データベース検索サイトを確立し、一般公開した。乳酸菌のモデル組換え体を食肉に添加し、定量PCR法により定量的な検知が可能であるか検討した。グラム陽性菌の組換え体にしばしば用いられる２種類のエリスロマイシン耐性遺伝子を標的として検知法を検討した。ゲノム上に挿入した“ery”とプラスミド上にコードする“ermC”のそれぞれのモデル組換え体を用いた検討により、純培養では定量的な検知が可能である方法を開発した。添加回収実験を行った食肉からは、２種のエリスロマイシン耐性遺伝子を保有する常在菌が分離された。それぞれStaphylococcus spp.及びStreptococcus spp.が分離できたことから、食品や環境中にこのような耐性菌が広く分布しているものと思われた。生分解性プラスチックの合成に頻用されている phb A と phb B 遺伝子につき人工合成してプラスミドに導入することでこれらの標準プラスミドを作成した。DNA チップ上にそれらの遺伝子の一部をプローブとして固定化を行い、それらの遺伝子とコメゲノムDNAを蛍光標識したものをハイブリダイズさせることによって、DNAチップ上でそれらの遺伝子を混入率約 1％程度まで検出することに成功した。医薬品及び環境浄化目的のGM植物の動向の調査研究を進め、開発例が多い食用作物は、イネ、トマトであり、意図しない食品への混入により健康危害が生じる可能性の高い経口ワクチンの開発ではコレラトキシンBサブユニット（CTB）が汎用されていることを明らかとした。機能性タンパク質であるミラクリンを生産する組換えトマトの入手及びCTB生産イネの作出を行い、それらの遺伝子検知法及びコピー数推定法を確立した。　非食用GM魚、ニワトリ、ブタについて開発状況を調査してデータベースを作成した。米国における臓器移植を目指したGMブタの報告が多数あることを明らかにした。また、ヒトエリスロポエチン遺伝子を導入された非食用GMニワトリの肉を検知する方法を確立した。この方法を利用して実態調査を行ったところ、ヒトエリスロポエチン遺伝子を導入された非食用GMニワトリの肉は市場から検出されなかった。

結論

結論：昨年に引き続きWeb公開用のデータベースの公開を継続した。確立した非食用ジャガイモ検知法の加工食品への応用と実態調査を行った。非食用GM微生物に関してはグラム陽性菌の組換え体にしばしば用いられる２種類のエリスロマイシン耐性遺伝子を標的として検知法を確立した。生分解性プラスチックの合成に頻用されている phb A と phb B 遺伝子につき人工合成してプラスミドに導入することでこれらの標準プラスミドを作成した。DNAチップ上でそれらの遺伝子を混入率約 1％程度まで検出することに成功した。機能性タンパク質であるミラクリンを生産する組換えトマトの入手及びCTB生産イネの作出を行い、それらの遺伝子検知法及びコピー数推定法を確立した。ヒトエリスロポエチン遺伝子を導入された非食用GMニワトリの肉を検知する方法を確立及び実態調査を行った。非食用モダンバイオテクノロジー応用植物・生物の開発の状況と検知法開発研究のまとめを行った。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-06-24
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201234001B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 非食用モダンバイオテクノロジー応用生物の食品への混入危害防止のための検知法開発に関する研究
• 課題番号: H22-食品-一般-001
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 穐山 浩(国立医薬品食品衛生研究所 食品添加物部)

研究分担者(所属機関)

• 五十君　靜信(国立医薬品食品衛生研究所　食品衛生管理部)
• 小関　良宏(国立大学法人東京農工大学大学院共生科学研究院生命機能科学分野)
• 吉松　嘉代(独立行政法人医薬基盤研究所薬用植物資源研究センター筑波研究部)
• 中島　治(国立医薬品食品衛生研究所　代謝生化学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 食品の安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

研究目的：非食用モダンバイオテクノロジーを応用した非食用植物・生物について食品への混入に関する安全性確保を実施するため、それらの動向の調査研究を進め、非食用モダンバイオテクノロジー応用植物・生物の食品中への混入を防止するための安全性確保に有用な検知法の開発を行うことを目的とする。

研究方法

研究方法：国内外における非食用モダンバイオテクノロジー応用植物・生物に関する開発・実用化の情報を収集し解析を行う。対象試料あるいは疑似試料に関しては入手または作製を検討する。また項目毎に非食用モダンバイオテクノロジー応用植物・生物に共通して利用される可能性の高い遺伝子の塩基配列情報を迅速に検出する手段の開発を検討し、検知法を確立する。確立された手法を混入の恐れのある試料から実態調査を行う。

結果と考察

結果と考察：リアルタイムPCR法を用いてトマト及びジャガイモ加工食品中に混入する可能性のある未承認非食用遺伝子組換え（GM）トマトあるいはジャガイモを検知する方法を開発した。その結果、トマトあるいはジャガイモ加工食品から精製したDNAを定性PCR法に供したところ、すべての加工食品において検出可能な増幅断片長は100 bp以下であった。この結果から、増幅断片長を100 bp以下に設計することで、標的遺伝子を検出できることが示唆された。非食用バイオテクノロジーの開発状況に関するWeb公開用データベース検索サイトを確立し、一般公開した。乳酸菌モデル組換え体を用いて、食品からの検知手法について検討した。グラム陽性菌の組換え体にしばしば用いられる２種類のエリスロマイシン耐性遺伝子を標的として検知法を開発した。生分解性プラスチックの合成に頻用されている phb A と phb B 遺伝子につき人工合成してプラスミドに導入することでこれらの標準プラスミドを作成した。DNA チップ上にそれらの遺伝子の一部をプローブとして固定化を行い、それらの遺伝子とコメゲノムDNAを蛍光標識したものをハイブリダイズさせることによって、DNAチップ上でそれらの遺伝子を混入率約 1％程度まで検出することに成功した。2006〜2010年に収集した医薬品用及び環境浄化用GM植物の開発・生産に関する情報405件を、カテゴリー別に集計した結果、機能性食品：120件、経口ワクチン：65件、食用医薬：25件、ワクチン抗原：36件、抗体医薬：36件、治療薬：76件、診断薬・試薬：15件、環境浄化：40件であり、機能性食品、経口ワクチン及び治療薬に関するものが多く、使用された食用作物は、イネ：51件、トマト：28件、レタス：22件、ジャガイモ：18件、トウモロコシ：15件であった医薬品及び環境浄化目的のGM植物の動向の調査研究を進め、開発例が多い食用作物は、イネ、トマトであり、意図しない食品への混入により健康危害が生じる可能性の高い経口ワクチンの開発ではコレラトキシンBサブユニット（CTB）が汎用されていることを明らかとした。機能性タンパク質であるミラクリンを生産する組換えトマトの入手及びCTB生産イネの作出を行い、それらの遺伝子検知法及びコピー数推定法を確立した。米国における臓器移植を目指したGMブタの報告が多数あることを明らかにした。また、ヒトエリスロポエチン遺伝子を導入された非食用GMニワトリの肉を検知する方法を確立した。この方法を利用して実態調査を行ったところ、ヒトエリスロポエチン遺伝子を導入された非食用GMニワトリの肉は市場から検出されなかった。

結論

結論：Web公開用のデータベースを確立し公開した。確立した非食用のGMトマト及びGMジャガイモ検知法の加工食品への応用と実態調査を行った。非食用GM微生物に関してはグラム陽性菌の組換え体にしばしば用いられる2種類のエリスロマイシン耐性遺伝子を標的として検知法を確立した。今回の研究によりまとめられたGM微生物のデータベースを参考にして、この中から検知に有用と思われる遺伝子を２種類以上決定し、コロニーハイブリダイゼーションにより評価する方法は、他の微生物組換え体の検知にも利用可能と思われる。工業用非食用GM作物に関しては生分解性プラスチックの合成に頻用されている phb A と phb B 遺伝子につき人工合成してプラスミドに導入することでこれらの標準プラスミドを作成した。DNAチップ上でそれらの遺伝子を混入率約 1％程度まで検出することに成功した。医薬品用及び環境浄化用GM植物に関しては機能性タンパク質であるミラクリンを生産する組換えトマトの入手及びCTB生産イネの作出を行い、それらの遺伝子検知法及びコピー数推定法を確立した。非食用GM動物に関してはヒトエリスロポエチン遺伝子を導入された非食用GMニワトリの肉を検知する方法を確立及び実態調査を行った。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-06-24
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201234001C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 経口ワクチンで良く用いられているコレラトキシンBサブユニット生産米の作出及びその検知法の開発をした。ミラクリンのトマトを温室栽培により、果実・自殖種子を取得し、その検知法を開発した。また工業用遺伝子組換えトウモロコシの検知を目的に遺伝子を増殖せずにDNAチップで多遺伝子を検出する方法を開発した。ヒトエリスロポエチン遺伝子を導入された非食用遺伝子組換え鶏の肉を検知する方法を開発した。3年間の論文業績は41件（国内論文8件、国際論文33件）であった。
• 臨床的観点からの成果: 国内外で開発されている経口ワクチンの遺伝子組換え米やトウモロコシ等が食品に混入し誤って摂食した場合など、生体内において免疫系に影響が予想され、重大な健康危害が懸念されることから、経口ワクチンで良く用いられているコレラトキシンBサブユニット生産米の作出及びその検知法の開発をしたことは、監視する検査法として有用であると思われる。
• ガイドライン等の開発: 工業用のアミロペクチンを算出するために非食用目的で開された遺伝子組換えジャガイモの検査法は、本ジャガイモが海外では承認されているが、わが国で承認されていないことから、監視するための検査法として有用である。
• その他行政的観点からの成果: 非食用バイオテクノロジーの開発状況のデータベース検索のWeb公開用ソフトを確立し、により一般公開した。非食用遺伝子組換えジャガイモ食品への混入防止の検査体制案を確立し、提示したいと考えている。
• その他のインパクト: 本研究で確立したデーターベースを国立衛研サーバーからWebで公開継続し、研究が今後進めば最新の情報を追加していきたい。また本研究で得られた情報及び検知技術を用いて流通の可能性がある非食用バイオテクノロジー応用植物・生物の混入実態調査に応用する。特に今後流通の可能性のある医療用経口ワクチン遺伝子組換え作物に関しては誤って流通すると健康被害の可能性があることから必要と考えている。

発表件数

• 原著論文（和文）: 8件
• 原著論文（英文等）: 33件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 45件
• 学会発表(国際学会等): 12件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 1件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Noguchi,A. Nakamura,K., Sakata,K. et al.; Interlaboratory Validation Study of an Event-Specific Real-time Polymerase Chain Reaction Detection Method for Geneticallly Modified 55-1 Papaya.; Journal of AOAC INTERNATIONAL (2013)
• 原著論文2: Ohmori,K., Nakamura,K., Kasahara,M., et al.; A novel DNA extraction and purification method using an ion-exchange resin type kit for the detection of genetically modified papaya in processed papaya products.; Food Control (2013)
• 原著論文3: Nakamura,K., Akiiyama,H., Takahashi,Y., et al.; Application of a qualitative and quantitative real-time polymerase chain reaction method for detecting genetically modified papaya line 55-1 in papaya products.; Food Chemistry , 136 (2) , 895-901 (2013)
• 原著論文4: Yoshimatsu, K., Kawano, N., Kawahara, N., et al.; Current status of application and commercialization of genetically modified plants for human and livestock health and phytoremediation; YAKUGAKU ZASSHI , 132 (5) , 629-674 (2012)
• 原著論文5: Kasama,K., Inoue,Y, Akiiyama,H., et al.; Proficiency testing of unauthorized genetically modified rice using plasmid DNA test samples.; Japanese Journal of Food Chemistry and Safety , 19 (3) , 215-222 (2012)
• 原著論文6: Akiyama,H., Minegishi,Y., Makiyama,D, et al.; Quantification and Idenification of Genetically Modified Maize Events in Non-Identity Preserved Maize Samples in 2009 using an Individual Kernel Detection System.; Food Hyg. Saf. Sci. , 53 (4) , 157-165 (2012)
• 原著論文7: Nakamura,K., Ohtsuki,T., Mori,H., et al.; Novel anti-HIV-1 activity produced by conjugating unsulfated dextran with polyL-lysine.; Antiviral Research , 94 , 89-97 (2012)
• 原著論文8: Mano J., Harada,M., Hatano,S. et al.; Single-laboratory validation of comprehensive GMO detection method using real-time PCR array; Journal of AOAC International , 95 , 508-516 (2012)
• 原著論文9: Ito,A., Taguchi,T., Mogi,T., et al.; Comparison of signal enhancement techniques using DNA microarrays for screening GM crops.; Jpn. J. Food Chem. Safety , 19 , 141-148 (2012)
• 原著論文10: Nakamura, K., Akiyama, H., Ohmori, K.,; Identification and Detection Method for Genetically Modified Papaya Resistant to Papaya Ringspot Virus YK Strain.; Biological & Pharmaceutical Bulletin , 34 (10) , 1648-1651 (2011)
• 原著論文11: Akiyama, H., Sakata, K., Makiyama, D., et al.; Inter-laboratory Study of DNA Extraction from Multiple Ground Samples, Multiplex Real-Time PCR and Multiplex Qualitative PCR for Individual Kernel Detection System of Genetically Modified Maize.; J. AOAC International , 94 (5) , 1540-1547 (2011)
• 原著論文12: Ohashi-Suzuki, M., Yabu, Y., Ohshima, S., et al.; Differential Kinetic Activities of Glycerol Kinase among African Trypanosome Species: Phylogenetic and Therapeutic Implications.; The Journal of Veterinary Medical Science , 73 (5) , 615-621 (2011)
• 原著論文13: Suzuki,A., Duc, H.P.N., Nakamura, K., et al.; Remarkable growth variation in a natural Japanese population of Pleurocybella porrigens. ; Japanese Journal of Food Chemistry and Safety , 81 , 18-23 (2011)
• 原著論文14: Masuda Kazuya. Akinobu Kajikawa, and Shizunobu Igimi.; Establishment and evaluation of an in vitro M cell model using C2BBe1 cells and Raji cells. ; Bioscience and Microflora. , 30 , 37-44 (2011)
• 原著論文15: Yoshimatsu,K., Kawano,N., Kawahara,N., et al.; Current status of application and commercialization of genetically modified plants for human and livestock health and phytoremediation,; YAKUGAKU ZASSHI , 132 , 1-47 (2012)
• 原著論文16: 清水えり、布藤聡、増渕友子 他; リアルタイムPCRによるDNA検査に好適なポリプロピレンチューブの選択方法; 食品衛生学雑誌 , 51 , 43-47 (2010)
• 原著論文17: Oguchi,T., Onishi,M., Mano,J., et al.; Development of multiplex PCR method for simultaneous detection of four events of genetically modified maize, DAS-59122-7, MIR604, MON863 and MON88017.; Food Hygiene and Safety Science , 51 , 92-100 (2010)
• 原著論文18: Abbott,M., Hayward,S., Ross,W., et al.; Procedures for Quantitative Food Allergen ELISA Methods:Community Guidance and Best Practices.; J.AOAC Int. , 93 , 442-450 (2010)
• 原著論文19: Akiyama,H., Sakata,K., Spiegelhalter,F., et al.; Interlaboratory Volidation of an Event-Specific Real time Polymerase Chain Reaction Detection Method for Genetically Modified DAS59132 maize.; Food Hygiene and Safety Science , 51 , 65-70 (2010)
• 原著論文20: Mano,J., Yanaka,Y., Akiyama,H., et al; Improvement of polymerase chain reaction-based Bt11 maize detection method by reduction of non-specific amplification.; Food Hygiene and Safety Science , 51 , 32-36 (2010)

公開日・更新日

• 公開日: 2014-06-02
• 更新日: 2016-06-09

収支報告書

• 文献番号: 201234001Z