文献情報
文献番号
199800135A
報告書区分
総括
研究課題名
細胞増殖および細胞接着の制御によるがん遺伝子治療法の開発
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
高久 史麿(自治医科大学)
研究分担者(所属機関)
- 濱田洋文(癌研究会癌化学療法センター)
- 今井浩三(札幌医科大学医学部)
- 平井久丸(東京大学医学部)
- 官澤文彦(国立がんセンター研究所)
- 間野博行(自治医科大学)
- 矢崎貴仁(慶應義塾大学医学部)
- 石坂幸人(国立国際医療センター研究所)
- 佐藤裕子(国立国際医療センター研究所)
- 湯尾明(国立国際医療センター研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 がん克服戦略研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
20,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
離れた部位に位置する細胞間の連絡をつかさどる液性因子(増殖因子、ホルモン、など)や、隣接する細胞間の接着と細胞相互の連絡に携わる因子(接着分子、など)の研究はいずれも現代細胞生物学における重要な研究課題である。その重要性は、がん細胞の増殖や進展においても同様であり、制御機構の解明は直接にがんの治療法にもつながる可能性を有している。近年、細胞の増殖や接着に関わる分子の構造が明らかにされ、その遺伝子が単離されるに及んで、この分野の研究の推進と臨床応用の可能性が広がってきた。本研究においては増殖因子、接着分子などの遺伝子もしくはその遺伝子産物を用いて、がんの増殖や周囲組織への浸潤、遠隔臓器への転移の機構を明らかにするとともに得られた知見を応用してがんのより有効な治療法、すなわちがんの増殖、浸潤、転移の制御による遺伝子治療法を開発することを目的として研究を進める。また、昨年度よりがん細胞を殺す手段として、アポトーシス関連遺伝子を用いる研究も採用され有望な結果を生み出しつつあり、本年度は、その効果的な応用の方策の探究をさらに行う。さらに、本年度はウイルスベクター側の遺伝子工学的な修飾によって、ベクターとして用いるウイルス自体にがん細胞を殺すような作用を持たせるという試みを開始する。
研究方法
細胞は遺伝子導入に使われうるさまざまのヒトおよびマウスの培養細胞株もしくはヒトの正常血球を用いた。樹状細胞の分離、誘導やCTLの誘導は標準的な手法により行った。遺伝子導入は、アデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスを用いた系や、リポゾームを介した系、膜受容体へのモノクローナル抗体を介したイムノジーン法などを用いた。一部の研究においては、ウイルス自体が抗腫瘍活性を有するベクターの系(アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス)を用いた。遺伝子発現は、細胞系列特異的なプロモーターなどを用いた。増殖は生細胞数の算定、アポトーシスは形態評価やDNA断片化などによってそれぞれ同定した。殺細胞効果は動物実験系においても確認した。遺伝子発現調節系はテトラサイクリン反応性プロモーターを用いて構築した。
結果と考察
1)アデノウイルスベクターを用いてアポトーシス関連遺伝子(Fas、Caspase、Bax、など)をグリオーマ細胞に導入し、アポトーシスを誘導できた。また、E1B欠損アデノウイルスのファイバーにK20の変異を導入しグリオーマに導入効率を高めたウイルスベクターは、in vivoも含めて治療に有用であった。
2)野生型p53-アデノウイルスベクターを樹状細胞に感染させ、マウスを免疫することにより、変異p53を発現した腫瘍細胞を退縮させるCTLを得ることに成功した。
3)慢性骨髄性患者末梢血より樹状細胞を取り出し、bcr/abl融合ペプチドをパルスして同患者のリンパ球と混合培養することによりペプチド特異的CTLを樹立した。
4)リポソーム化アデノウイルス由来DNA-Terminal protein complexの静脈内投与によりマウス皮下腫瘍に遺伝子の導入が可能であった。
5)アルファフェトプロテイン(AFP)遺伝子のプロモーター下流にシトシンデアミナーゼ(CD)cDNAを挿入した発現ユニットを作成し、5-fluorocytosine (5FC)併用遺伝子治療法を試みたところ、in vitroにおいてもin vivoにおいても肝細胞癌特異的に細胞死を誘導した。
6)腫瘍特異的に細胞毒性を示すヘルパーウイルス(HSV-G207)を用いて、浸潤抑制因子TIMP2、腫瘍ワクチン誘導因子IFN-γをおのおの発現するdefective HSV vectorを構築し,in vitroとin vivoでその抗腫瘍効果を確認した。両vectorともにHSV-G207単独よりも強力な抗腫瘍効果を示し、in vivoではTIMP2発現vectorが最も強い効果を発揮した。
7)細胞特異的遺伝子導入を目指して、レセプター型チロシンキナーゼ(RET)、神経芽腫細胞、胆道がん、大腸がんの未知膜抗原、等に対するモノクローナル抗体を作成した。これらのうちRETに対する抗体を用いて、神経芽腫細胞、造血幹細胞での遺伝子導入、発現を確認した。
8)ヒト白血病におけるt(1;12)転座の転座切断点を明らかにし、転座の結果生じる融合遺伝子TEL/ARG融合mRNAの解析を行った。
9)転写因子として知られているCREB蛋白(及びそのC末端ペプチド断片)に、腫瘍細胞を殺傷する(アポトーシスを介して)作用があることが明らかになった。
さまざまの種類のがん細胞において、特定の遺伝子導入や特定の変異型ウイルスが腫瘍細胞のアポトーシスや増殖抑制を誘導することなどが明らかにされ、がんの遺伝子治療法の新しいモデルがいくつか示された。今後は、これらの実験系が臨床応用につながるような具体的な研究の推進が重要であると考えられた。また、得られた結果の中には全く新しい知見もあり、その機序の解析などの基礎検討も併せて進める必要があると考えられる。
2)野生型p53-アデノウイルスベクターを樹状細胞に感染させ、マウスを免疫することにより、変異p53を発現した腫瘍細胞を退縮させるCTLを得ることに成功した。
3)慢性骨髄性患者末梢血より樹状細胞を取り出し、bcr/abl融合ペプチドをパルスして同患者のリンパ球と混合培養することによりペプチド特異的CTLを樹立した。
4)リポソーム化アデノウイルス由来DNA-Terminal protein complexの静脈内投与によりマウス皮下腫瘍に遺伝子の導入が可能であった。
5)アルファフェトプロテイン(AFP)遺伝子のプロモーター下流にシトシンデアミナーゼ(CD)cDNAを挿入した発現ユニットを作成し、5-fluorocytosine (5FC)併用遺伝子治療法を試みたところ、in vitroにおいてもin vivoにおいても肝細胞癌特異的に細胞死を誘導した。
6)腫瘍特異的に細胞毒性を示すヘルパーウイルス(HSV-G207)を用いて、浸潤抑制因子TIMP2、腫瘍ワクチン誘導因子IFN-γをおのおの発現するdefective HSV vectorを構築し,in vitroとin vivoでその抗腫瘍効果を確認した。両vectorともにHSV-G207単独よりも強力な抗腫瘍効果を示し、in vivoではTIMP2発現vectorが最も強い効果を発揮した。
7)細胞特異的遺伝子導入を目指して、レセプター型チロシンキナーゼ(RET)、神経芽腫細胞、胆道がん、大腸がんの未知膜抗原、等に対するモノクローナル抗体を作成した。これらのうちRETに対する抗体を用いて、神経芽腫細胞、造血幹細胞での遺伝子導入、発現を確認した。
8)ヒト白血病におけるt(1;12)転座の転座切断点を明らかにし、転座の結果生じる融合遺伝子TEL/ARG融合mRNAの解析を行った。
9)転写因子として知られているCREB蛋白(及びそのC末端ペプチド断片)に、腫瘍細胞を殺傷する(アポトーシスを介して)作用があることが明らかになった。
さまざまの種類のがん細胞において、特定の遺伝子導入や特定の変異型ウイルスが腫瘍細胞のアポトーシスや増殖抑制を誘導することなどが明らかにされ、がんの遺伝子治療法の新しいモデルがいくつか示された。今後は、これらの実験系が臨床応用につながるような具体的な研究の推進が重要であると考えられた。また、得られた結果の中には全く新しい知見もあり、その機序の解析などの基礎検討も併せて進める必要があると考えられる。
結論
本研究により、改変型アデノウイルスや改変型単純ヘルペスウイルスなどの変異ウイルス自体の殺細胞効果と、Casapase8やCREBなどの特定の遺伝子によるアポトーシス誘導が明らかにされ、新たな遺伝子治療の可能性が示された。また、樹状細胞を用いた新しい免疫遺伝子治療法、ベクター機能を有するモノクローナル抗体を用いた腫瘍特異的な遺伝子デリバリーシステム、臓器特異的な遺伝子発現システム、なども開発された。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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