アレルギー疾患感受性遺伝子であるヒスタミンH1受容体遺伝子の発現抑制作用を持つ天然物を用いる治療戦略

文献情報

• 文献番号: 201229005A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: アレルギー疾患感受性遺伝子であるヒスタミンH1受容体遺伝子の発現抑制作用を持つ天然物を用いる治療戦略
• 課題番号: H22-免疫-一般-005
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 福井 裕行(国立大学法人徳島大学 大学院ヘルスバイオサイエンス研究部)

研究分担者(所属機関)

• 武田　憲昭(国立大学法人徳島大学　大学院ヘルスバイオサイエンス研究部)
• 荻野　敏(国立大学法人大阪大学　大学院医学系研究科)
• 水口　博之(国立大学法人徳島大学　大学院ヘルスバイオサイエンス研究部)
• 柏田　良樹(国立大学法人徳島大学　大学院ヘルスバイオサイエンス研究部)
• 根本　尚夫(国立大学法人徳島大学　大学院ヘルスバイオサイエンス研究部)
• 斎藤　博久(独立行政法人国立成育医療研究センター研究所)
• 中山　勝文(国立大学法人東北大学　加齢医学研究所)
• 有信　洋二郎(国立大学法人九州大学病院　遺伝子細胞療法部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 難治性疾患等克服研究（免疫アレルギー疾患等予防・治療研究）
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 20,354,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　苦参に含まれるヒスタミンH1受容体（H1R）遺伝子発現抑制物質、(-)Maackiain（(-)MKN）の分子薬理機構解明のために、H1R刺激によるH1R遺伝子発現亢進分子機構を解明する。
　（(-)MKN）の喘息病態抑制、感作成立過程抑制作用を明らかにするために、自然免疫駆動アレルギー炎症モデルを作成する。
　カビアレルギーの発症メカニズムにおけるPKCδ／HSP90シグナルの関与を明らかにするために、(-)MKN、Quercetin（QCN）、及び、Apigenin（AGN）のβ-glucan刺激マクロファージ炎症応答に対する抑制効果について解析する。
　喘息におけるHSP90の関与を明らかにするために、Celastrolの効果を喘息モデルマウスにて検証する。更に、皮膚炎の改善効果を期待する薬剤の評価を正確に行うためのin vitro皮膚炎モデルを構築する。

研究方法

１．PKC-δシグナルを、PKC-δのリン酸化と細胞内移行により測定した。H1R遺伝子転写調節因子の同定を行った。(-)MKNの標的分子同定を行った。鼻過敏症モデルラットによる症状とH1R遺伝子発現を調べた。
２．自然免疫型のアレルギー気道炎症モデルを用いて解析した。
３．マウス骨髄細胞より分化誘導したマクロファージをβ-1,3-glucanで刺激し、IL-6、TNF-αの上昇、PKC-δ、NF-κB、MAPK経路の活性化に対する(-)MKN、AGN、QCN、Celastrolの抑制効果を調べた。
４．喘息モデルマウスの気管支肺胞洗浄液中の好酸球、骨髄中の骨髄球系共通前駆細胞、顆粒球・単球系前駆細胞、好酸球前駆細胞の増加、及び、末梢血の白血球分画に対するCelastrolの抑制作用を調べた。
５．In vitroでの皮膚炎評価系として、３次元air-liquid interface共培養系を構築した。

結果と考察

１．H1R遺伝子プロモーターは、領域A（２ヶ所のAP-1、１ヶ所のEts-1）、及び、領域B（PARP-1の活性化によるKu86/Ku70複合体の領域Bからの解離）によることが明らかとなった。
２．(-)MKNはHSP90に結合し、PKC-δのGolgi体移行を抑制することにより、H1R刺激によるH1R mRNAレベル上昇を抑制した。Celastrol（HSP90抑制薬）は、鼻過敏症モデルラットの症状改善、及び、H1R mRNAレベル上昇の抑制作用を示した。
３．鼻過敏症モデルラットの症状は、PKC-δシグナル、及び、新規シグナル抑制により高度に改善することを明らかにした（特許申請準備中）。
４．C57BL/6Nマウスにpapainを吸入させることによって、7日後を最大とするBALF中への好酸球優位の炎症細胞の増加が認められた。
５．カビ細胞壁成分、Curdlan刺激マクロファージにおけるIL-6、TNF-α産生は(-)MKN、AGN、QCNによって抑制された。Curdlan刺激マクロファージにおいて、AGNおよび(-)MKNはPKC-δ、ERKのリン酸化を抑制し、QCNはPKC-δのリン酸化、NF-κBの活性化を抑制した。HSP90阻害剤、CLSはCurdlanによるIL-6、TNF-α産生を抑制し、NF-κB、ERKの活性化を抑制した。
６．Celastrolの腹腔内投与により、気管支肺胞洗浄液中への好酸球浸潤は著明に抑制された。

結論

　鼻過敏症症状の主要シグナルはH1R／PKC-δ・HSP90／ERK／PARP-1／転写調節因子（AP-1, Ets-1, Ku86/Ku70複合体／H1R遺伝子発現亢進に至るシグナルであり、H1R遺伝子プロモーターは、領域A（AP-1、Ets-1）、及び、領域B（Ku70／Ku86複合体の解離）により調節される。(-)MKN、AGNはHSP90を標的分子とし、H1R遺伝子発現亢進を抑制する。抗ヒスタミン薬の薬効発現機構は、H1R遺伝子発現亢進に対する抑制作用であると考えられる。
　鼻過敏症症状の高度改善のために、PKC-δシグナルに続く第二のシグナルの同定、それを抑制する天然物とその有効成分を同定した。
　(-)MKNは苦参抽出物の作用と同様に、マウス喘息モデルにおいて、IL-4などのアレルギー性炎症関連サイトカインやKC/CXCL1などのケモカインの産生を抑制し、急性喘息の病態を軽減する可能性が考えられた。
　苦参由来生理活性物質マーキアインはLPS刺激のマクロファージによる炎症性サイトカイン産生を抑制するが、そのメカニズムの一部はH1R経路の阻害による。
　苦参は、分化過程における好酸球上へのCCR3発現を抑制した。また、ダニ抽出物誘導性皮膚炎の炎症も改善する可能性が示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-06-17
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201229005B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: アレルギー疾患感受性遺伝子であるヒスタミンH1受容体遺伝子の発現抑制作用を持つ天然物を用いる治療戦略
• 課題番号: H22-免疫-一般-005
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 福井 裕行(国立大学法人徳島大学 大学院ヘルスバイオサイエンス研究部)

研究分担者(所属機関)

• 武田　憲昭(国立大学法人徳島大学　大学院ヘルスバイオサイエンス研究部)
• 荻野　敏(国立大学法人大阪大学　大学院医学系研究科)
• 水口　博之(国立大学法人徳島大学　大学院ヘルスバイオサイエンス研究部)
• 柏田　良樹(国立大学法人徳島大学　大学院ヘルスバイオサイエンス研究部)
• 根本　尚夫(国立大学法人徳島大学　大学院ヘルスバイオサイエンス研究部)
• 斎藤　博久(独立行政法人国立成育医療研究センター研究所)
• 中山　勝文(国立大学法人東北大学　加齢医学研究所)
• 有信　洋二郎(国立大学法人九州大学病院　遺伝子細胞療法部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 難治性疾患等克服研究（免疫アレルギー疾患等予防・治療研究）
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　アレルギー疾患感受性遺伝子であるヒスタミンH1受容体（H1R）遺伝子の発現亢進を抑制する苦参に含まれる有効成分の同定、分子薬理機構解明を行う。更に、H1R遺伝子と同時に抑制することにより、アレルギー性鼻炎の症状を高度に抑制するための第２の感受性遺伝子の同定、この遺伝子発現を抑制する天然物と有効成分の同定、及び、分子薬理機構解明を行う。
　苦参、及び、その有効成分による喘息モデルマウス、皮膚炎モデルマウスの改善を調べ、細菌感染性炎症、アレルギー性炎症、骨髄球系細胞の分化、マクロファージ炎症応答、好酸球分化に対する抑制作用を調べる。

研究方法

　１．培養細胞を用い、H1R遺伝子発現亢進の分子機構解明をシグナル分子のリン酸化、細胞内移動、遺伝子プロモーター機能解析により行う。以上の結果を用いて、苦参由来H1R遺伝子発現抑制物質の分子薬理機構解明を行う。２．苦参と併用投与することにより、高度な症状改善を来す新規天然物医薬同定のためにアレルギー性鼻炎モデルラットを用いて行う。３．苦参とその有効成分による急性喘息モデルマウスの症状、血清IgG1、IgE、BALF中の炎症細胞数及びサイトカイン濃度変化、LPS刺激マウス骨髄由来マクロファージのNF-kB、MAPK活性上昇及び炎症性サイトカイン上昇に対する抑制作用、骨髄系細胞から顆粒球・単球及び好酸球への分化に対する抑制、皮膚炎モデルマウスに対する改善作用を調べる。

結果と考察

　１．苦参のIL-4、H1R遺伝子発現抑制物質として(－)マーキアイン（(-)MKN）を同定した。(-)MKNはHSP90に結合し、PKCδの活性化、Golgi体移行を抑制し、H1R遺伝子発現を抑制した。２．鼻過敏症モデルラットの症状は、HSP90抑制薬により改善された。３．(-)MKNと天然物由来新規シグナル抑制薬により約90 %が改善した（特許申請準備中）。４．苦参は急性喘息モデルマウスの気道抵抗値、BALF好酸球浸潤、IL-4 レベル上昇を抑制した。４．苦参、(-)MKNはLPS刺激マクロファージのIL-6、及び、TNF-α上昇をほゞ完全に抑制した。(-)MKN、apigenin、quercetinはカビ細胞壁成分刺激マクロファージにおけるIL-6、TNF-α産生、PKC-δ、ERKのリン酸化を抑制し、HSP90阻害剤はIL-6、TNF-α産生、NF-κB、ERK活性化を抑制した。５．苦参は黄色ブドウ球菌感染による皮膚炎モデルマウスの炎症開始を抑制した。

結論

　アレルギー性鼻炎において、H1R刺激によるPKCδ活性化とGolgi体移行シグナルがH1R遺伝子発現亢進を引き起こし、症状悪化を引き起こすと考えられる。苦参のH1R遺伝子発現抑制薬、(-)MKNはHSP90に結合し、PKCδ活性化とGolgi体移行を抑制した。H1R遺伝子発現抑制薬と併用投与によりアレルギー性鼻炎モデルラットの症状を90 %改善する新規疾患感受性遺伝子を抑制する天然物とその有効成分を同定した。喘息モデルマウスの好酸球性炎症に対して、苦参は抑制作用を示し、IL-4、KC/CXCL1の産生を抑制した。苦参はIL-6とTNF-αの産生を抑制し、黄色ブドウ球菌誘発皮膚炎モデルマウスの発症遅延作用を示した。(-)MKNはマクロファージのH1Rを介した炎症性サイトカイン産生に対する抑制能及び好酸球のCCR3発現に対する抑制能を持ち、気管支喘息、アトピー性皮膚炎の症状改善能を持つことが明らかとなった。苦参は、分化過程における好酸球上へのCCR3発現を抑制した。また、ダニ抽出物誘導性皮膚炎の炎症も改善する可能性が示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-06-24
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201229005C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: ヒスタミンH1受容体（H1R）刺激がPKCδ-MEK-ERK-PARPを経てH1R遺伝子発現を亢進させ、花粉症の60 %に関与することを示唆した。抗アレルギー天然物、苦参の有効成分、(-)マーキアイン（(-)MKN）はHSP90に結合し、PKCδ-HSP90複合体解離とPKCδのゴルジ体移行抑制によりH1R遺伝子発現抑制を引き起こした。抗アレルギー和漢薬、小青竜湯、及び、抗アレルギーフラボノイド、ケルセチンの作用も苦参と同様の作用であることが示唆された。症状に関与する第２のシグナルとして、IL-9遺伝子発現亢進シグナルを見いだし、阿波晩茶、レンコンなどの天然物がIL-9遺伝子発現抑制作用を持つことを明らかにした。更に、阿波晩茶由来抑制物質を同定した。両シグナルの抑制により鼻過敏症症状の90 %が抑制された。以上の病理機構に加えて、PKCδ活性化がIL-33遺伝子発現亢進を介して好酸球増多に関与する可能性を見出した。
• 臨床的観点からの成果: アレルギー疾患の症状は、主要治療薬である抗ヒスタミン薬により、約60 %が改善されることが示唆される。PKCδ活性を抑制する抗アレルギー天然物の有効成分による治療は抗ヒスタミン薬と同じシグナルを抑制して、症状改善を引き起こす。PKCδ抑制では改善できない症状は新規に見いだしたシグナルを抑制する医薬と併用することにより90 %の改善がもたらされる。好酸球増多を伴うアレルギー疾患に対する有効な治療法はなかったが、PKCδ活性抑制薬が有効な治療薬として期待できる。
• ガイドライン等の開発: 抗ヒスタミン薬、或いは、PKCδシグナルを抑制する天然物と第２のアレルギーシグナル、IL-9遺伝子発現を抑制する天然物の併用による治療法をガイドラインで推奨する価値がある。
• その他行政的観点からの成果: 有効成分の同定が行われ、薬理機構が解明された抗アレルギー天然物は科学的に検証された治療が可能である。そして、医療費の抑制が期待できる。アレルギー疾患の中で、比較的症状の軽い場合、科学的検証の行われた抗アレルギー天然物による治療法を用いる価値がある。天然物医薬、及び、機能性食品などの基準を改正する必要がある。また、抗アレルギー天然物の薬理機構解明が進展することにより、他のアレルギー疾患治療薬との併用、及び、天然物の投与量の設定が可能となる。
• その他のインパクト: 疾患の治療薬を開発するためには、病理機構の裏付けが解明された創薬ターゲットを明確にする必要がある。アレルギー疾患の新規創薬ターゲットとして、PKCδシグナル、及び、第２のアレルギーシグナル、IL-9遺伝子発現亢進シグナルを明らかにした。更に、好酸球増多に対する有効な治療薬開発の可能性を明らかにした。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 11件
• その他論文(和文): 11件
• その他論文(英文等): 1件 ; Biomedical aspects of histamine; new perspectives. Springer.
• 学会発表(国内学会): 45件
• 学会発表(国際学会等): 6件
• その他成果(特許の出願): 10件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: 鼻粘膜検体内部標準遺伝子
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 2010-258476 ; 発明者名: 福井裕行、水口博之、武田憲昭 ; 権利者名: 徳島大学 ; 出願年月日: 20101119 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 抗アレルギー組成物、抗アレルギー物質セット、及び抗アレルギー物質セットの製造方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 2011-011472 ; 発明者名: 福井裕行、水口博之、武田憲昭 ; 権利者名: 徳島大学 ; 出願年月日: 20110122 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 鼻過敏症予防・治療剤
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 2012-040703 ; 発明者名: 福井裕行、武田憲昭、水口博之 ; 権利者名: 徳島大学 ; 出願年月日: 20120227 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 抗アレルギー剤およびインターロイキン４遺伝子発現抑制剤、ならびにそれらの製造方法および使用方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 2015-048286 ; 発明者名: 内田勝幸、木村勝紀、溝口智奈也、福井裕行、武田憲昭、柏田良樹、水口博之 ; 権利者名: （株）明治、徳島大学 ; 出願年月日: 20150311 ; 国内外の別: 国内

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Horio S, Fujimoto K, Mizuguchi H, et al.; Interleukin-4 up-regulates histamine H1 receptors by activation of H1 receptor gene transcription.; Naunyn-Schmied Arch Pharmacol , 381 (4) , 305-313 (2010)
• 原著論文2: Mizuguchi H, Kitamura Y, Kondo Y, et al.; Pre-seasonal prophylactic treatment with antihistamines suppresses nasal symptoms and expression of histamine H1 receptor mRNA in the nasal mucosa of patients with pollinosis.; Methods Find Exp Clin Pharmacol , 32 (10) , 745-748 (2010)
• 原著論文3: Dev S, Mizuguchi H, Das AK, et al.; Proteomic Microarray analysis reveals suppression of histamine signaling by Kujin alleviates allergic symptoms by inhibition of NF-κB activation through down-regulation of FAT10 mRNA expression.; Int Immunopharmacol , 11 (10) , 1504-1509 (2011)
• 原著論文4: Mizuguchi H, Terao T, Kitai M, et al.; Involvement of PKC{delta}/ERK/Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) signaling pathway in histamine-induced up-regulation of histamine H1 receptor gene expression in HeLa cells.; J Biol Chem , 286 (35) , 30542-30551 (2011)
• 原著論文5: Nurul IM, Mizuguchi H, Shahriar M, et al.; Albizia lebbeck suppresses histamine signaling by the inhibition of histamine H1 receptor and histidine decarboxylase gene transcriptions.; Int Immunopharmacol , 11 (11) , 1766-1772 (2011)
• 原著論文6: Mizuguchi H, Ono S, Hattori M, et al.; Inverse agonistic activity of antihistamines and suppression of histamine H1 receptor gene expression.; J Pharmacil Sci , 118 (1) , 117-121 (2012)
• 原著論文7: Kitamura Y, Mizuguchi H, Ogishi H, et al.; Pre-seasonal prophylactic treatment with antihistamines suppresses IL-5, but not IL-33 mRNA expression in the nasal mucosa of patients with seasonal allergic rhinitis caused by Japanese cedar pollen.; Acta Otolaryngol , 132 (4) , 434-438 (2012)
• 原著論文8: Mizuguchi H, Miyagi K, Terao T, et al.; PMA-induced dissociation of Ku86 from the promoter causes transcriptional up-regulation of histamine H1 receptor.; Scientific Reports , 2 (916) , 1-11 (2012)
• 原著論文9: Hattori M, Mizuguchi H, Baba Y, et al.; Quercetin inhibits transcriptional up-regulation of histamine H(1) receptor via suppressing protein kinase C-δ/extracellular signal-regulated kinase/poly(ADP-ribose) polymerase-1 signaling pathway in HeLa cells.; Int Immunopharmacol , 15 (2) , 232-239 (2013)
• 原著論文10: Mizuguchi H, Ono S, Hattori M, et al.; Usefulness of HeLa cells to evaluate inverse agonistic activity of antihistamines.; Int Immunopharmacol , 15 (3) , 539-543 (2013)
• 原著論文11: Kuroda W, Kitamura Y, Mizuguchi H, et al.; Combination of leukotoriene receptor antagonist with antihistamine has an additive suppressive effect on the up-regulation of H1 receptor mRNA in the nasal mucosa of toluene 2,4-diisocyanate-sensitized rat.; J Pharmacol Sci , 122 (1) , 55-58 (2013)

公開日・更新日

• 公開日: 2013-07-01
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201229005Z