皮膚バリア障害によるアレルギーマーチ発症機序解明に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201229003A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 皮膚バリア障害によるアレルギーマーチ発症機序解明に関する研究
• 課題番号: H22-免疫-一般-003
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 天谷 雅行(慶應義塾大学 医学部)

研究分担者(所属機関)

• 菅井　基行(広島大学　大学院医歯薬学総合研究科)
• 工藤　純(慶應義塾大学　医学部)
• 加藤　則人(京都府立医科大学　大学院医学研究科)
• 浅野　浩一郎(東海大学　医学部)
• 松井　毅(京都大学　物質－細胞統合システム拠点 （iCeMS）)
• 海老原　全(慶應義塾大学　医学部)
• 久保　亮治(慶應義塾大学　医学部)
• 永尾　圭介(慶應義塾大学　医学部 )

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 難治性疾患等克服研究（免疫アレルギー疾患等予防・治療研究）
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 28,980,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究では、皮膚バリア機能障害の観点から、アレルギーマーチを起こすアトピー性疾患の発症に関する病態解明を行い、皮膚バリア機能補正によるアレルギー疾患発症抑制・予防への分子基盤を確立する。フィラグリン欠損に伴う角層バリア機能障害に起因するアレルギーマーチ発症機序を解明するとともに、フィラグリン以外のアトピー性疾患発症新規因子を同定する。
　本年度は、フィラグリンノックアウト（KO） マウスをヘアレスマウスに交配し、より効率的な角層機能評価系を確立するとともに、経皮抗原感作による喘息モデルマウスを免疫学的に解析する。アトピー性皮膚炎（AD)患者皮膚において高率に検出される黄色ブドウ球菌が、皮膚炎発症後付着するのか、皮膚炎発症前からフィラグリンが欠損しているだけで皮膚に付着しやすくなるのか、フィラグリン欠損の有無と黄色ブドウ球菌の角層への付着性、固着性の関連を検討する。フィラグリン欠損時､皮膚炎発症時のタイトジャンクションの構造、機能を解析する。本研究開始時より継続的に行っているフィラグリン遺伝子新規変異の探索、フィラグリン以外の皮膚バリア機能関連蛋白の遺伝子解析を進めるとともに、日本人データの蓄積、バリア機能低下とアレルギー性疾患発症の疫学的解析を継続する。

研究方法

フィラグリンKOマウスをHos:HR-1マウスと交配し、フィラグリンKOヘアレスマウスを作成した。角層内水分量とTEWLを、標準湿度環境(湿度40-60%)下で、それぞれVAPOSCAN AS-VT100RS (Asahi Biomed), Corneometer ASA-M2(Asahi Biomed)を用いて測定、評価した。フィラグリンKO角層における黄色ブドウ球菌付着性・固着性の検討に関しては、AmCyan遺伝子を黄色ブドウ球菌発現用ベクターpKATに組込み、AD由来黄色ブドウ球菌TF3378株に導入し、GFP発現黄色ブドウ球菌を作製した。また、黄色ブドウ球菌の各種疾患由来臨床分離21株について、Illumina GIIxを用いてゲノムのドラフト配列を取得し、アトピー性皮膚炎由来株の特徴を解析した。

結果と考察

フィラグリンKOマウスとヘアレスマウスを交配し、より詳細に角層、表皮を観察する事が可能となった。親から離乳し、脱毛が終わる6週齡以降より、フィラグリンKOヘアレスマウスで角層内水分量の減少を認めたことにより、フィラグリン欠損は角層水分量の低下を導くが、毛で体表を覆われたり親の保護を受けたりする時期は、フィラグリン欠損があっても何らかの代償機構により、見かけ上角層水分量が維持された可能性が示唆された。また、体毛等の保護がなくなるとフィラグリン欠損マウスでは角層水分量の低下が進むことから、乾燥等の環境要因がフィラグリン欠損皮膚の角層水分保持に影響する可能性が考えられた。
　AD由来ブドウ球菌株は野生型の皮膚より著しく強くフィラグリン欠損皮膚に固着していた。付着の程度は野生型、フィラグリンKOマウスで顕著な違いが認められないため、付着した後の皮膚での増殖に違いが生じたと考えられるが、その機序は不明である。アトピー性皮膚炎由来株の比較ゲノム解析アプローチから、特有遺伝子の保有等が見つかってきた。今後、これらの遺伝子の皮膚固着性への関与を解析する必要がある。今回の結果はアトピー性皮膚炎患者から分離される黄色ブドウ球菌の病理学的意義を明らかにする糸口になる可能性があると考えられる。さらに、TACE/SOX9マウスは掻痒や高IgE値を示すと共に、黄色ブドウ球菌のcolonizationというヒトのアトピー性皮膚炎に特徴的な表現型を示すことが明らかとなった。今後はTACE/SOX9マウス皮膚における黄色ブドウ球菌の増殖の機序および皮膚炎悪化への関与を解明したい。
　次世代シーケンサーの膨大なデータ量を利用して、FLG-NGS shotgun法を新たに開発した。AD患者36人から4種類のFLG変異を新たに同定した。このうち２種類の新規変異は以前にFLG-shotgun法で全解読した際には見落としていたものであり、FLG-NGS shotgun法は、従来法に比べて簡便で低コストであるばかりか検出精度も上がっていることが実証された。このことから日本人集団にはこれまでの解析では見落とされていた頻度の低い未知のFLG変異が多く存在する事が予測された。

結論

本研究の成果により、アレルギーマーチを起こすアトピー性疾患の発症機序において、皮膚バリア障害による持続的経皮免疫が根本的な要因であることを示す確固たる免疫学的基盤が確立されつつある。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-05-30
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201229003B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 皮膚バリア障害によるアレルギーマーチ発症機序解明に関する研究
• 課題番号: H22-免疫-一般-003
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 天谷 雅行(慶應義塾大学 医学部)

研究分担者(所属機関)

• 菅井　基行(広島大学　大学院医歯薬学総合研究科)
• 工藤　純(慶應義塾大学　医学部)
• 加藤　則人(京都府立医科大学　大学院医学研究科)
• 浅野　浩一郎(東海大学　医学部)
• 松井　毅(京都大学　物質－細胞統合システム拠点 （iCeMS）)
• 海老原　全(慶應義塾大学　医学部)
• 久保　亮治(慶應義塾大学　医学部)
• 永尾　圭介(慶應義塾大学　医学部 )

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 難治性疾患等克服研究（免疫アレルギー疾患等予防・治療研究）
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究では、皮膚バリア機能障害の観点から、アレルギーマーチを起こすアトピー性疾患の発症に関する病態解明を行い、皮膚バリア機能補正によるアレルギー疾患発症抑制・予防への分子基盤を確立する。フィラグリン欠損に伴う角層バリア機能障害に起因するアレルギーマーチ発症機序を解明するとともに、フィラグリン以外のアトピー性疾患発症新規因子を同定する。

研究方法

フィラグリンノックアウト（KO）マウスの角層機能を評価宇するとともに、喘息モデルマウスの開発を行う。日本人アトピー性皮膚炎患者において、フィラグリン遺伝子に変異が認められのは、我々の検討では約25％に過ぎず、フィラグリン以外の発症因子として、フィラグリン分解酵素であるSASPase、TACE(ADAM17)の可能性を検討する。アトピー性皮膚炎患者皮膚から高頻度に分離される黄色ブドウ球菌の皮膚炎における役割を検討する。アトピー性皮膚炎病変部皮膚を用いて、 タイトジャンクション （TJ） バリアと表皮内樹状細胞との立体位置関係、樹状細胞の機能変化について検討する。

結果と考察

フィラグリンKOマウスの安定供給が確立し，多角的に機能解析することが可能となった。フィラグリンが欠損することのより、角層下層に見られ、角層構造を補強していると考えられているケラチンパターンが消失しており，物理的に角層構造が脆弱になっていることが明らかとなった。経皮的なダニ抗原感作によってTh17サイトカイン発現と遷延性の好酸球性気道炎症、IgE抗体産生、気道粘液産生が、フィラグリンKOマウスは野生型に比べて亢進していた。皮膚におけるフィラグリン欠損の有無が、肺における気道炎症の性質に影響を与えることが初めて示された。
　フィラグリンKOマウスは、フィラグリンの最終分解産物である天然保湿因子が低下しており、乾燥皮膚の表現型を呈す。ところが、プロフィラグリンの分解異常を示すSASPase欠損無毛マウスにおいて、天然保湿因子は正常でありながら、乾燥皮膚を呈することが示された。SASPase欠損無毛マウスは、乾燥皮膚に至る新しい分子機構を解明する上で、有用なツールとなる。
　TACE cKOマウスはSPF下において皮膚炎を自然発症し、掻破行動、高IgE血症の出現が認められ、内因性アトピー性皮膚炎様の表現型を呈している。バリアおよび免疫学的観点から、かゆみおよび皮膚炎発症の内因性機序を解明する重要なモデルとなる。アトピー性疾患発症新規関連因子として、プロテアーゼGが、プロフィラグリン分解に関わる事を明らかにした。今後、アトピー性皮膚炎患者ゲノムにおけるヒトプロテアーゼGの遺伝子解析を行い、乾燥肌やアトピー性皮膚炎発症機序に新たな展開がうまれることが期待される。
　アトピー性皮膚炎患者から分離された黄色ブドウ球菌株は、野生型マウスに比べ、著しく強くフィラグリンKOマウス皮膚に固着していることが示された。この事実は，フィラグリンを欠損した角層は、炎症を起こす以前に、ある特定の黄色ブドウ球菌が固着しやすくなることを示唆しており，アトピー性皮膚炎発症における黄色ブドウ球菌の役割を解明する上で重要な知見となる。フィラグリン欠損角層にどうして固着しやすくなるのか、遺伝子レベル、分子レベルでさらに詳細な解析を進める予定である。
　SSSSマウスモデルを用いて，ランゲルハンス細胞（LC)は， TJの外側から捕捉した細菌毒素に対して中和活性を示すIgG抗体産生を誘導し，皮膚の構造を保ちながら外来抗原に対して免疫応答を成立させることを明らかにした。免疫応答において、ランゲルハンス細胞は制御的な役割をするという知見が蓄積している昨今において，細菌に対する防御免疫を惹起する事実が示された意義は大きい。アトピー性皮膚炎における抗原感作機構を明らかにするのみならず、経皮ワクチンを開発する上においても重要な知見となる。
　マウスのみならず、ヒト皮膚においても、TJバリアを３次元的に観察する方法論を確立し，AD皮膚において、LCと炎症性表皮樹状細胞（IDEC）は表皮内で異なる位置に存在し，LCはTJを超えて樹状突起を伸ばすが、IDECは主に水平方向に樹状突起を伸ばすことが観察された。LCはTJの外側から，IDECはTJより下で表皮内から抗原を捕捉することが示唆され、アトピー性皮膚炎発症におけるこれらの細胞は異なる役割を持つことが明らかとなった。

結論

本研究の成果により、アレルギーマーチを起こすアトピー性疾患の発症機序において、皮膚バリア障害による持続的経皮免疫が根本的な要因であることを示す確固たる免疫学的基盤が着実に確立されつつある。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-05-30
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201229003C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 世界に先駆けて、フィラグリンKOマウスを作成し、角層機能を解析した（JACI, 2012）。また、新規タイトジャンクション構成蛋白を同定した(J Cell Sci 2012)。プロフィラグリンを分解する新規酵素SASPaseを同定した（EMBO Mol Med, 2011）。角層バリア、タイトジャンクションバリア、ランゲルハンス細胞による免疫バリアのアトピー性疾患発症における重要性を示すことができた（J Clin Invest 2012)。
• 臨床的観点からの成果: フィラグリンKOマウスを用いた喘息モデルが作成され、経皮感作と肺における炎症の発症機序がTh17を介していることを明らかにした。フィラグリンKOマウス皮膚には、アトピー性皮膚炎患者から分離された黄色ブドウ球菌株が選択的に固着する事実を示した。ヒト皮膚において、タイトジャンクションを三次元可視化し、ランゲルハンス細胞との相互関係を示した。京都府山間部という特定の地域においてスキンケアに関する教育介入により、スキンケアによるアトピー性皮膚炎発症予防の可能性が示された。
• ガイドライン等の開発: 該当せず。
• その他行政的観点からの成果: 本研究により、より本来の病態に即したアトピー性皮膚炎モデルマウスが作成され、皮膚バリア障害と気管支喘息発症との関連性および、免疫学的共通基盤が明らかにされた。将来的に、出生時よりスキンケアを適切に行い、皮膚バリア機能を改善、維持することによりアトピー性疾患、喘息の発症を予防することが可能となり、厚生行政に多大なる貢献をすることが期待される。
• その他のインパクト: 日経メディカル特別編集版2「大規模遺伝子解析で何が分かるか アレルギー病大会名に迫る最新手法」2011.2月,NHK朝イチ「アトピー性皮膚炎を治せ！」2011.9.15,NHKスペシャル「アレルギーを治せ」2011.11.20,日経産業新聞朝刊「アトピー性関連遺伝子領域 理研が8個発見」2011.10.12,週刊エコノミスト 2011.11月初週号「健康アプリ ⑧アトピー性皮膚炎」2011.11.6,朝日新聞 夕刊「皮膚の炎症 毛包が指令 脱毛症・アトピー性治療に期待」2012.7.5,朝日新聞朝刊「新生児から保湿 アトピーリスク３割減」2014.5.9,NHKおはよう日本「アトピー性皮膚炎 原因は細菌の異常繁殖か」2015.4.22

発表件数

• 原著論文（和文）: 45件
• 原著論文（英文等）: 50件
• その他論文(和文): 2件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 70件
• 学会発表(国際学会等): 70件
• その他成果(特許の出願): 1件 ; 国内1件
• その他成果(特許の取得): 1件 ; 国際1件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 10件

特許

• 特許の名称: アレルギー疾患モデル動物
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: WO2009/139191 ; 発明者名: 天谷雅行、久保亮治、永尾圭介 ; 権利者名: 学校法人慶應義塾 ; 出願年月日: 20090515 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: Allergic Disease Model Animals
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: US2011/0088103 ; 発明者名: Masayuki Amagai, Akiharu Kubo, Keisuke Nagao ; 権利者名: Keio University ; 出願年月日: 20090515 ; 取得年月日: 20130108 ; 国内外の別: 国外

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Moniaga CS, Egawa G, Kawasaki H, et al.; Flaky tail mouse denotes human atopic dermatitis in the steady state and by topical application with Dermatophagoides pteronyssinus extract; Am J Pathol , 176 (5) , 2385-2393 (2010); S0002-9440(10)60034-X [pii] 10.2353/ajpath.2010.090957
• 原著論文2: Kawasaki H, Kubo A, Sasaki T, et al.; Loss-of-function mutations within the filaggrin gene and atopic dermatitis; Curr Probl Dermatol , 41 , 35-46 (2011); 10.1159/000323291 000323291 [pii]
• 原著論文3: Matsui T, Miyamoto K, Kubo A, et al.; SASPase regulates stratum corneum hydration through profilaggrin-to-filaggrin processing; EMBO Mol Med , 3 (6) , 320-333 (2011); 10.1002/emmm.201100140
• 原著論文4: Ouchi T, Kubo A, Yokouchi M, et al.; Langerhans cell antigen capture through tight junctions confers preemptive immunity in experimental staphylococcal scalded skin syndrome; J Exp Med , 208 (13) , 2607-2613 (2011); 10.1084/jem.20111718 jem.20111718 [pii]
• 原著論文5: Kubo A, Nagao K, Amagai M.; Epidermal barrier dysfunction and cutaneous sensitization in atopic diseases; J Clin Invest , 122 (2) , 440-447 (2012); 57416 [pii] 10.1172/JCI57416
• 原著論文6: Kawasaki H, Nagao K, Kubo A, et al.; Altered stratum corneum barrier and enhanced percutaneous immune responses in filaggrin-null mice; J Allergy Clin Immunol , 129 (6) , 1538-1546 (2012); S0091-6749(12)00256-4 [pii] 10.1016/j.jaci.2012.01.068
• 原著論文7: Nagao K, Kobayashi T, Moro K, et al.; Stress-induced production of chemokines by hair follicles regulates the trafficking of dendritic cells in skin; Nat Immunol , 13 (8) , 744-752 (2012); 10.1038/ni.2353 ni.2353 [pii]
• 原著論文8: Nagao K, Kobayashi T, Ohyama M, et al.; Brief Report: Requirement of TACE/ADAM17 for Hair Follicle Bugle Niche Establishment; Stem Cells , 30 (8) , 1781-1785 (2012); 10.1002/stem.1153
• 原著論文9: Hirota T, Takahashi A, Kubo M, et al.; Genome-wide association study identifies eight new susceptibility loci for atopic dermatitis in the Japanese population; Nat Genet , 44 (11) , 1222-1226 (2012); 10.1038/ng.2438 ng.2438 [pii]
• 原著論文10: Sasaki T, Niizeki H, Shimizu A, et al.; Identification of mutations in the prostaglandin transporter gene SLCO2A1 and its phenotype-genotype correlation in Japanese patients with pachydermoperiostosis; J Dermatol Sci , 68 (1) , 36-44 (2012); S0923-1811(12)00240-X [pii] 10.1016/j.jdermsci.2012.07.008
• 原著論文11: Kubo A, Nagao K, Amagai M.; 3D visualization of epidermal langerhans cells; Methods Mol Biol , 961 , 119-127 (2013); 10.1007/978-1-62703-227-8_5
• 原著論文12: Kanda S, Sasaki T, Shiohama A, et al.; Characterization of canine filaggrin: gene structure and protein expression in dog skin; Vet Dermatol , 24 (1) , 25-31 (2013); 10.1111/j.1365-3164.2012.01105.x
• 原著論文13: Sasaki T, Shiohama A, Kubo A, Kawasaki H, et al.; A homozygous nonsense mutation in the gene for Tmem79, a component for the lamellar granule secretory system, produces spontaneous eczema in an experimental model of atopic dermatitis; J Allergy Clin Immunol , 132 (5) , 1111-1120 (2013); 10.1016/j.jaci.2013.08.027
• 原著論文14: Kubo A, Shiohama A, Sasaki T, et al.; Mutations in SERPINB7, encoding a member of the serine protease inhibitor superfamily, cause nagashima-type palmoplantar keratosis; Am J Hum Genet , 93 (5) , 945-956 (2013); 10.1016/j.ajhg.2013.09.015
• 原著論文15: Masaki K, Suzuki Y, et al.; Dual role of interleukin-23 in epicutaneously-sensitized asthma in mice; Allergol Int , 60 (Suppl 1) , 13-22 (2014); 10.2332/allergolint.13-OA-0632
• 原著論文16: Sasaki T, Furusyo N, et al.; Filaggrin loss-of-function mutations are not a predisposing factor for atopic dermatitis in an Ishigaki Island under subtropical climate; J Dermatol Sci , 76 (1) , 10-15 (2014); 10.1016/j.jdermsci.2014.06.004
• 原著論文17: Yoshida K, Kubo A, Fujita H, Yokouchi M, et al.; Distinct behavior of human Langerhans cells and inflammatory dendritic epidermal cells at tight junctions in atopic dermatitis.; J Allergy Clin Immunol , 134 (4) , 856-864 (2014); 10.1016/J.Jaci.2014.08.001
• 原著論文18: Kobayashi T, Glatz M, Horiuchi K, et al.; Dysbiosis and Staphyloccus aureus Colonization Drives Inflammation in Atopic Dermatitis; Immunity , 42 (4) , 756-866 (2015); 10.1016/j.immuni.2015.03.014

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-22
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201229003Z