文献情報
文献番号
201228014A
報告書区分
総括
研究課題名
免疫系を保持した次世代型Ｂ型肝炎ウイルス感染小動物モデルの開発とその応用
課題番号
H24-B創-肝炎-一般-015
研究年度
平成24(2012)年度
研究代表者(所属機関)
竹原 徹郎(大阪大学大学院 医学系研究科消化器内科学)
研究分担者(所属機関)
- 巽 智秀(大阪大学大学院 医学系研究科消化器内科学 )
- 疋田 隼人(大阪大学大学院 医学系研究科消化器内科学 )
- 上田 啓次(大阪大学大学院 医学系研究科ウイルス学)
- 水口 裕之(大阪大学大学院 薬学研究科分子生物学分野)
- 仲野 徹(大阪大学大学院 生命機能研究科時空生物学病因解析学)
- 末水 洋志(公益財団法人実験動物中央研究所バイオメディカル研究部)
- 高橋 武司(公益財団法人実験動物中央研究所実験動物研究部免疫研究室)
- 中村 雅登(公益財団法人実験動物中央研究所病理病態研究部)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 B型肝炎創薬実用化等研究
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成28(2016)年度
研究費
83,334,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
B型肝炎の病態を解明し、画期的な創薬研究を推進するためには、動物モデルの解発が必要である。uPA-SCIDモデルはマウス個体内でHBVの複製を可能にした優れたモデルであるが、自然発症劇症肝炎を基盤としているため管理に労力がかかり高コストである、短命である、獲得免疫応答を保持していない等の問題点がある。本研究課題では、１）免疫系を保持したB型肝炎モデルを作成し、B型肝炎に対する免疫応答を解析すること、２）長期生存可能な安定した新規肝細胞キメラマウスを作成すること、３）iPS細胞からマウスの肝臓および免疫系をヒト化するドナー細胞を誘導する技術を開発し、同系のヒト肝細胞・免疫細胞とHBVがマウス個体内で相互作用し病態形成をするモデルを作出することを目的に研究を行う。
研究方法
STEP 1：ハイドロダイナミック法を用いたHBV増殖系
増殖可能なHBVゲノムを種々のマウス系統に投与し、ウイルス増殖と免疫病態を解析する。
STEP 2：マウス免疫系のヒト細胞による再構築
NOGを背景としたマウスに、ヒト末梢血単核球、ヒト臍帯血幹細胞等を投与し免疫系を再構成する。STEP 1のHBV増殖システムを用いて、HBVに対するヒトの免疫応答を解析する。
STEP 3：マウス免疫機能を保持したヒト肝細胞置換マウスの作成
肝細胞が形成されない遺伝子改変マウス（Bcl-xL/Mcl-1 KO）の胎児期にヒト初代培養肝細胞を移植し、ヒト肝細胞に対して免疫寛容が成立したマウスを作成する。作出したマウスに、HBV患者血清を接種し、HBVに対するマウス免疫応答を解析する。無症候性HBVキャリアのモデルとしての有用性を検討する。
STEP 4：新規ヒト肝細胞置換マウスの作成と免疫系のヒト細胞による再構成
TK-NOGマウスに経脾門脈的にヒト肝細胞を移植する。同マウスにHBV患者血清を投与し、HBV感染性を検討する。また、Mcl-1 KOを基盤に新たなヒト肝細胞キメラマウスを作出する。これらのマウスをSTEP 2の方法により免疫系をヒト化し、マウスの個体内で同種ヒト細胞が相互作用するモデルを作成する。免疫学的には肝移植後に類似しており、移植後肝炎のモデルとしての有用性を検討する。
STEP 5：ES/iPS細胞を用いた肝臓と免疫系のヒト細胞再構成
ヒトiPS細胞より分化度の高い肝細胞を誘導する。TK-NOGマウスに、誘導した肝細胞を投与し、ヒト肝細胞キメラマウスを作成する。また、ES/iPS由来造血幹細胞が生着・分化する至適条件を検討する。両者を同一の個体に移植することにより、マウスの個体内で同系のヒト細胞が相互作用するモデルの作成を行う。
増殖可能なHBVゲノムを種々のマウス系統に投与し、ウイルス増殖と免疫病態を解析する。
STEP 2：マウス免疫系のヒト細胞による再構築
NOGを背景としたマウスに、ヒト末梢血単核球、ヒト臍帯血幹細胞等を投与し免疫系を再構成する。STEP 1のHBV増殖システムを用いて、HBVに対するヒトの免疫応答を解析する。
STEP 3：マウス免疫機能を保持したヒト肝細胞置換マウスの作成
肝細胞が形成されない遺伝子改変マウス（Bcl-xL/Mcl-1 KO）の胎児期にヒト初代培養肝細胞を移植し、ヒト肝細胞に対して免疫寛容が成立したマウスを作成する。作出したマウスに、HBV患者血清を接種し、HBVに対するマウス免疫応答を解析する。無症候性HBVキャリアのモデルとしての有用性を検討する。
STEP 4：新規ヒト肝細胞置換マウスの作成と免疫系のヒト細胞による再構成
TK-NOGマウスに経脾門脈的にヒト肝細胞を移植する。同マウスにHBV患者血清を投与し、HBV感染性を検討する。また、Mcl-1 KOを基盤に新たなヒト肝細胞キメラマウスを作出する。これらのマウスをSTEP 2の方法により免疫系をヒト化し、マウスの個体内で同種ヒト細胞が相互作用するモデルを作成する。免疫学的には肝移植後に類似しており、移植後肝炎のモデルとしての有用性を検討する。
STEP 5：ES/iPS細胞を用いた肝臓と免疫系のヒト細胞再構成
ヒトiPS細胞より分化度の高い肝細胞を誘導する。TK-NOGマウスに、誘導した肝細胞を投与し、ヒト肝細胞キメラマウスを作成する。また、ES/iPS由来造血幹細胞が生着・分化する至適条件を検討する。両者を同一の個体に移植することにより、マウスの個体内で同系のヒト細胞が相互作用するモデルの作成を行う。
結果と考察
STEP 1：Genotype AおよびGenotype CのHBV遺伝子をそれぞれ1.2-merタンデムに繋いだ発現プラスミドを作成した。Balb/cAマウスにハイドロダイナミック法にて投与したところ、約5%の肝細胞でHBc抗原が陽性となり、HBs抗原血症が成立した。
STEP 2：NOG-MHC class I/class II KOマウスにヒト末梢血単核球を移植した。ヒトNK細胞、樹状細胞、B細胞、T細胞が経時的に増加し、移植後28日で約90%の単核球がヒト細胞に置換された。NOGマウスへの移植で認められるGVH応答は著明に抑制され、肝障害も極めて軽微であり、マウス免疫系ヒト化の有望なツールになることが示された。
STEP 3：ED16.5の胎児の卵黄嚢静脈よりvehicleを投与し、最も生存率のよい手技について検討した。野生型胎児にGFPマウス由来初代培養肝細胞を投与し、生下時において、GFP陽性肝細胞がマウス肝臓内に生着していることを確認した。
STEP 4：TK-NOGにヒト肝細胞を移植した。ヒト肝細胞への置換率が30-40%のTK-NOGマウスにGenotype A、Genotype Cの患者血清を投与した。血清投与1-2週の極めて早期からマウス血中でHBV DNAが陽性となりTK-NOGマウスにおけるHBV感染が確認された。Mcl-1 KOマウスを免疫不全化するためにNODマウスに戻し交配を開始した。
STEP 5：ヒトiPS細胞由来分化誘導肝細胞からなる細胞シートを肝障害免疫不全マウスに移植し、血中ヒトアルブミン濃度が100-2000 ng/mLに上昇することを確認した。ヒトiPS細胞からCD34陽性細胞への分化誘導に成功した。
STEP 2：NOG-MHC class I/class II KOマウスにヒト末梢血単核球を移植した。ヒトNK細胞、樹状細胞、B細胞、T細胞が経時的に増加し、移植後28日で約90%の単核球がヒト細胞に置換された。NOGマウスへの移植で認められるGVH応答は著明に抑制され、肝障害も極めて軽微であり、マウス免疫系ヒト化の有望なツールになることが示された。
STEP 3：ED16.5の胎児の卵黄嚢静脈よりvehicleを投与し、最も生存率のよい手技について検討した。野生型胎児にGFPマウス由来初代培養肝細胞を投与し、生下時において、GFP陽性肝細胞がマウス肝臓内に生着していることを確認した。
STEP 4：TK-NOGにヒト肝細胞を移植した。ヒト肝細胞への置換率が30-40%のTK-NOGマウスにGenotype A、Genotype Cの患者血清を投与した。血清投与1-2週の極めて早期からマウス血中でHBV DNAが陽性となりTK-NOGマウスにおけるHBV感染が確認された。Mcl-1 KOマウスを免疫不全化するためにNODマウスに戻し交配を開始した。
STEP 5：ヒトiPS細胞由来分化誘導肝細胞からなる細胞シートを肝障害免疫不全マウスに移植し、血中ヒトアルブミン濃度が100-2000 ng/mLに上昇することを確認した。ヒトiPS細胞からCD34陽性細胞への分化誘導に成功した。
結論
各ステップについて初年度においてほぼ当初の予定通りの計画を達成した。来年度以降もこれらの研究を推進し、個々のステップを統合していくことにより、最終的に免疫系が保持され、肝細胞が長期安定して置換され、ヒトの同系細胞が相互作用する次世代型HBV感染小動物モデルを作成し、創薬研究に応用していく計画である。
公開日・更新日
公開日
2015-06-03
更新日
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