文献情報
文献番号
201228006A
報告書区分
総括
研究課題名
Ｂ型肝炎ウイルスにおける糖鎖の機能解析と医用応用技術の実用化へ
課題番号
H24-B創-肝炎-一般-007
研究年度
平成24(2012)年度
研究代表者(所属機関)
成松 久(独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター)
研究分担者(所属機関)
- 溝上 雅史(独立行政法人国立国際医療研究センター 肝炎・免疫研究センター)
- 是永 匡紹(独立行政法人国立国際医療研究センター 肝炎・免疫研究センター)
- 米田 政志(学校法人愛知医科大学 医学部 内科学講座 消化器内科)
- 伊藤 清顕(学校法人愛知医科大学 医学部 内科学講座)
- 飯島 沙幸(公立大学法人名古屋市立大学 医学研究科)
- 伊藤 浩美(公立大学法人福島県立医科大学 生化学講座)
- 梶 裕之(独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター)
- 千葉 靖典(独立行政法人産業技術総合研究所 生物プロセス研究部門)
- 久野 敦(独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター)
- 栂谷内 晶(独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター)
- 佐藤 隆(独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター)
- 舘野 浩章(独立行政法人産業技術総合研究所 幹細胞工学研究センター)
- 安形 清彦(独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 B型肝炎創薬実用化等研究
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成28(2016)年度
研究費
95,094,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
日本には約150万人のB型肝炎ウイルス（HBV）保有者がいると考えられ、我が国ではユニバーサルワクチネーションが行われておらず、母子感染に加え水平感染による新規感染が起きている。B型肝炎においてはIFNによる治療成績が悪い場合が多く、核酸アナログ薬の継続投与でも薬剤耐性ウイルスの出現が問題になっている。従って、逆転写酵素に代わる創薬ターゲットの発見が必須である。本研究は、HBVの感染過程における糖鎖の機能を明らかにし、HBVの感染を阻害する薬剤のシーズを探索する。ウイルス粒子の形成や分泌に関わる糖鎖構造を同定し、抗HBVの創薬の標的とする。また、ヒト型糖鎖を持つHBs抗原を開発し新規ワクチンの開発を目指す。
研究方法
本研究では、HBV感染における糖鎖の機能を解析し、HBVに対する創薬実用化を図るために、糖鎖機能解析技術を開発・実用化して来た産総研・糖鎖グループと肝疾患やHBV作製・感染実験の専門家から構成される肝臓グループとが協力体制を構築し以下のテーマについて研究した。１）HBVの糖鎖解析：種々のGenotypeのHBV（HBs抗原）を調製し、レクチンアレイ技術や質量分析技術を応用し糖鎖解析を行う。２）HBV感染可能細胞の糖鎖解析：グライコプロテオミクス技術を用いHBV感染可能細胞と非感染可能細胞の糖鎖プロファイリングを行う。３）HBV-宿主細胞における糖鎖の役割：HBs抗原を発現する粒子と肝細胞の内在性レクチンを用い、HBVと宿主肝細胞との相互作用解析系の開発を進める。４）糖鎖改変のHBVの増殖・感染能への影響：肝細胞の糖鎖合成系を阻害し、HBV粒子の形成・分泌能を比較する。５）糖鎖修飾を受けたHBs抗原の大量精製：ヒト型糖鎖を発現する酵母を用い、HBs抗原の大量精製を行う。
結果と考察
１）HBs抗原をレクチンアレイによる検出する方法の開発を進め、候補レクチンを選定し、微量検出系の開発に繋がる結果を得た。グライコプロテオミクス解析により精製HBs抗原中のL-HBs抗原のN末側（HBV認識領域と考えられている領域）にもN型糖鎖修飾を確認した。これまでに、HBV上の糖鎖と病体あるいは個人間の差などの解析は殆ど行われておらず、HBVおよびHBs抗原の糖鎖構造を多量サンプルについて簡便に解析する方法の開発は有用であると考えられる。２）HBV非感染性のHuH7細胞とHepG2細胞について質量分析による糖鎖構造解析（N-glycan/ O-glycan解析）を行った。N-結合型糖鎖については両細胞間の糖鎖構造は類似していたが、O-結合型糖鎖はシアリル化糖鎖構造の相対量に両細胞間で差がある結果となった。現在感染可能な肝細胞やヒト肝化マウス組織・細胞（±HBV感染）を解析中であり、HBV感染と糖鎖の関係をより詳細に比較解析する。３）グライコプロテオーム解析の結果を基に、内在性レクチンの検索を行い候補分子をクローニングした。タグ付きHBs抗原を発現し、HBs抗原の細胞への吸着を定量化する方法を検討した。他班で研究されるHBV受容体との感染促進効果や阻害実験などを行い、HBVの感染機構の解明へと貢献したい。４）糖鎖遺伝子qPCRアレイにより糖鎖遺伝子発現を解析し、糖鎖遺伝子を2群（抑制目的と過剰発現目的）に分け、cDNAとsiRNAライブラリーの作成を進め、糖鎖改変細胞作製の準備を行った。糖鎖合成阻害剤のHBV分泌や感染への影響も解析しており、糖鎖改変細胞の影響を詳細に解析する事により、創薬ターゲットの選定に繋げる。５）ヒト型糖鎖を有するHBs抗原調製のために、HBs抗原をコードする遺伝子4種について、出芽酵母の最適コドンに変換し発現させた。２種のcDNAに由来するクローンでL-HBs抗原の発現に成功し、少なくとも一つのN型糖鎖修飾を有することを確認した。抗体産生試験を行い、現在ワクチンとして用いられている糖鎖を持たないS-HBs抗原と比較し、より有効なワクチンの開発に繋げたい。
結論
１年次である平成24年度には精製HBs抗原のグライコプロテオミクス解析、肝癌細胞の細胞膜プロテオミクス解析、糖鎖遺伝子解析と医用応用のための基盤研究を行った。また、内在性レクチンとL-HBs抗原の調製、cDNAやsiRNAライブラリーの調製、酵母発現用HBs抗原ベクターの開発等を行い、B型肝炎を治療する創薬ターゲットの開発やHBVの感染を防ぐワクチンの実用化へ展開していきたい。
公開日・更新日
公開日
2015-06-03
更新日
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