次世代生命基盤技術を用いたＢ型肝炎制圧のための創薬研究

文献情報

文献番号

201228002A

報告書区分

総括

研究課題名

次世代生命基盤技術を用いたＢ型肝炎制圧のための創薬研究

課題番号

H24-B創-肝炎-一般-003

研究年度

平成24(2012)年度

研究代表者(所属機関)

小嶋　聡一(独立行政法人理化学研究所)

研究分担者(所属機関)

松浦　知和(東京慈恵会医科大学)
鈴木　治和(独立行政法人理化学研究所)
金井　好克(大阪大学大学院)
堂前　直(独立行政法人理化学研究所)
名越　澄子(埼玉医科大学総合医療センター)
小川　健司(独立行政法人理化学研究所)
平野　秀典(独立行政法人理化学研究所)
鈴木　正昭(独立行政法人理化学研究所)
吾郷　日出夫(独立行政法人理化学研究所)
相崎　英樹(国立感染症研究所)
土屋　好司(東京理科大学)
種村　健太郎(東北大学大学院)
渡辺　恭良(独立行政法人理化学研究所)

研究区分

厚生労働科学研究費補助金疾病・障害対策研究分野 B型肝炎創薬実用化等研究

研究開始年度

平成24(2012)年度

研究終了予定年度

平成28(2016)年度

研究費

300,000,000円

研究者交替、所属機関変更

-

研究報告書（概要版）

研究目的

現在HBV治療の中心は核酸アナログですが、ウイルスの完全排除は望めず、投与中止に伴う再増殖や長期投与に伴う耐性ウイルス発生の問題を抱えつつ薬を一生飲み続けなければなりません。この状況から脱するために、核酸アナログ以外の有望な薬剤候補３つ以上を同事業終了までに製薬会社に提供することを目的として、研究分担者１３名、研究協力者９名からなる研究体制を確立、パイロット実験を行い、今後４年間の研究計画の見通しを立てました。

研究方法

１）次年度臨床検体収集・網羅的解析による新規標的分子同定の準備（松浦グループ）６大学７施設の倫理審査・承認を得て、臨床検体受入れ体制を整備。まだ樹立されていない遺伝子型D以外HBV感染細胞株の樹立を試みました。網羅的解析のパイロット実験として、次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトーム解析、マイクロアレイデータのインフォマティクス解析を実施しました。より生体肝に近い代謝系を発現するようにしたヒト肝細胞がん細胞株FLC-4の三次元培養系を、網羅的比較発現定量プロテオミクス手法を開発して解析しました。
２）新規抗HBV剤高速化合物探索系確立と病態改善候補薬の展開・評価（小嶋グループ）
脇田班よりHepaRG細胞を用いた生活環前期の探索系/Hep2.2.15細胞を用いた生活環後期の探索系を導入、高速評価化するとともに、独自高速評価化合物探索系を構築、最適化して化合物探索を開始しました。Ｂ型肝炎に付随する肝線維化改善薬候補を合成展開、動物モデルで薬効を確認、京コンピュータによる計算化合物探索、NMRによる構造解析を実施しました。
３）安全性・有効性の評価系構築（相崎グループ）
安全性・有効性の評価にどのような動物モデル系が使えるかを吟味。新規毒性アレイや網羅的代謝解析が応用できるかを検討しました。薬物動態に関する薬物輸送分子の追跡プローブを開発。PETを用いた薬効評価法を準備しました。

結果と考察

１）各施設IRBでの審査・承認を経て、2013年１月より臨床検体収集開始。年間で劇症肝炎、若年発癌など特徴ある臨床病態を示すHBV感染症例200検体を収集の見通し。遺伝子型 DのHep2.2.15細胞とは異なる遺伝子型 AeのHBV発現細胞株を樹立。HBV産生株であるHep2.2.15細胞とその親株のヒト肝細胞がん細胞HepG2細胞との転写活性化能の違いが約1,500個ずつの遺伝子で増減、ラミブジン処理Hep2.2.15細胞では約100個ずつ増減を観察。三次元培養時に約1,000分子が増, 500分子が減。ヒット化合物の作用機序に用いる比較定量リン酸化プロテオミクス手法を確立。患者検体を用いたプロテオーム解析のためマウス臓器を用いてプロトコルを最適化中です。
２）化合物探索研究体制を固め、消光性核酸プローブ(Eprobe)を用い384穴プレートと細胞イメージング装置を駆使したHBV pg RNA標的抗ウイルス剤化合物探索系高速評価化に成功、等温核酸増幅法OmegaAmpによるHBV DNA指標抗ウイルス剤の高速評価化合物探索系作製に着手。スプリットルシフェラーゼを用いるコアタンパク質カプシド形成阻害化合物の高速評価探索系を構築、大量高速化合物探索を開始しました。TGFβ LAP断片標的HBV付随肝線維化検出法と治療候補化合物NPD8673を開発。ヒト肝細胞移植キメラマウスで薬効を確認しました。経口可能なIFN疑似薬の合成展開に着手しました。新規HBV薬の探索に４か月、ヒット化合物、標的分子の情報を基に計算化合物探索、誘導体を精密有機合成、立体構造解析して、有望な化合物を得て動物実験まで１０か月の見通しを立てました。
３）既存培養細胞系やヒト肝移植キメラマウスモデル、赤毛サル等大動物、新規毒性アレイ評価系、網羅的代謝評価系も用い、抗ウイルス効果の評価・安全性調べる系を構築、キメラマウスから調製した新鮮肝細胞を各種感染実験に用いることを決定。薬物動態・薬効評価のため核酸・抗体分子プローブ標識法とPET撮像システムを整備しました。

結論

各施設IRBの審査・承認を得、臨床検体収集を開始、新規標的分子同定に向けた網羅的解析系を確立、HBV産生株と親株での転写活性化の違いや三次元培養でのタンパク発現の違いを観察しました。消光性核酸プローブやスプリットルシフェラーゼを用いた、pgRNA生成阻害薬やカプシド形成阻害薬の高速化合物探索系を構築、大規模化合物探索を開始しました。HBV付随肝線維化改善薬剤候補NPD8673の薬効をマウスモデルで確認。新規毒性アレイ評価系、網羅的代謝評価系を構築、PET分子視覚化技術を用いた薬効評価・薬物動態評価を準備しました。平成２５年度はこれらの技術を用い、目的達成に向け同事業内の他班との連携研究を積極的に推進します。