ウイルス性肝炎に対する治療ワクチンの開発に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201227011A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ウイルス性肝炎に対する治療ワクチンの開発に関する研究
• 課題番号: H22-肝炎-一般-011
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 小原 道法(公益財団法人東京都医学総合研究所 ゲノム医科学研究分野)

研究分担者(所属機関)

• 保富　康宏(独立行政法人医薬基盤研究所　霊長類医科学研究センター)
• 瀬谷　司(北海道大学大学院・先端生命科学研究院)
• 鈴木　亮介(国立感染症研究所ウイルス第二部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 肝炎等克服緊急対策研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 35,415,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　C型肝炎ウイルス(HCV)感染者に対するインターフェロン治療は副作用等の問題も大きい。他方で、HCVは感染することにより80％の被感染者が慢性化してしまうが、20％は慢性化せず自己の免疫によりウイルスを排除する。これらのことは、免疫を賦活化することによりウイルスのコントロールができる可能性を示唆している。そこで本研究ではHCV及びHBV特異的免疫賦活化による根治を目指した治療的ワクチンの開発を目的とする。

研究方法

HCVN25-RVV を慢性肝炎状態のHCV/Cre-Tgに接種し、HCV排除及びその作用機序を解析した。炎症性サイトカインの定量、肝臓、脾臓リンパ球での抗原特異的CTLsの検出などの解析を行った。慢性肝炎の病態形成にTNF-a, IL-6の関与が示唆されたため、炎症性単球M１マクロファージ（M1Mφ）やM2マクロファージ（M2Mφ）の分布変化について解析した。また、HCV遺伝子発現DNAワクチンを作製し、慢性肝炎状態のHCV/Cre-Tgに接種し、HCV蛋白質の排除及びその作用機序を解析した。
さらに、遺伝子型1a、1b、2a、3a由来HCVの遺伝子配列を用い、coreからNS2領域を発現するHCVtcpを作製した。HCVのE1およびE2に反応するマウスモノクローナル抗体およびウサギ抗血清についての感染中和活性の評価の為に、段階希釈した各種抗体または抗血清とHCVtcpを室温で１時間反応させ、その後ウイルス液をHuh7.5.1細胞に添加し、感染させた。２日後の培養上清のG Lucの活性を測定し、コントロール群と比較する事により、感染中和活性を評価した

結果と考察

　rVV-N25の作用機序を調べるために、このマウスにrVV-N25を接種し、接種後の免疫細胞の動きをFACS解析したところ、肝臓におけるIMおよびMφが減少する事が明らかとなった。rVV-N25による肝臓内のIM, Mφの減少がC型肝炎の正常化に繋がるかどうか調べるために、Mφをクロドロネート（clo）で枯渇させたところ、肝臓の病態が改善し、さらにrVV-N25とCloとの併用でも肝臓の病態が正常化する事が分かった。さらにこの機序について解析を進める。
より抗原特異的な細胞性免疫を主体とした免疫反応を誘導すべくHCV各種遺伝子を用いたDNAワクチンを開発した。HCVの非構造蛋白領域を発現するDNAワクチン（HCV-N25）は、マウス肝臓中のHCVコア蛋白発現量を有意に減少させ、肝細胞の膨化や索状配列の乱れなどの形態学的異常を改善させた。しかし、HCV-DNAワクチン投与後の脾細胞のHCV抗原特異的IFN-γ産生能は減弱あるいは消失しており、HCV蛋白が発現することで免疫抑制の状態になり、強い細胞性免疫が誘導できていないことが考えられる。HCV-Tgマウス由来樹状細胞のCTL誘導能は正常であるが、HCV-Tgマウス体内で樹状細胞からT細胞への、CTL誘導につながるどこかの部分に障害があり、WTマウスに比べてCTL誘導が抑制されていると考えられる。これらの機構が解明されれば、治療用ワクチンのさらなる開発に繋がることが考えられる。また、HCV-Tgマウス体内でより強く細胞性免疫を誘導できるような投与法として、DNAワクチンとワクシニアウイルスを用いたprime/boost法について検討したところ、細胞性免疫が増強することを確認した。
　HCVレプリコンのレポーター遺伝子をG Luc遺伝子に置換する事により検出感度が約１００倍高まり、従来の方法では感染価が認められなかった株を用いてHCVtcpを作製する事が出来た。本研究による複数の遺伝子型／株由来のHCVtcpを用いる事により、迅速、簡便な感染中和アッセイのスクリーニングが可能となり、幅広い遺伝子型に対して活性を示す中和抗体の探索が期待される。

結論

　Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子組換えワクチン及びDNAワクチンで効果が認められたので、さらに、細胞内免疫活性化剤や構築したHCV-DNAワクチンを併用することで治療効果増強法の検討、抗体価の測定や細胞性免疫応答の解析を行った。HCVの非構造蛋白領域を発現するDNAワクチン（HCV-N25）はC型肝炎モデルマウスを用いた実験の結果より、治療用ワクチンとして有用である可能性が示された。HCV-TgマウスにおけるHCVに対する免疫抑制機構についての解析が進めば、さらにHCV-N25の効果を増強することが期待できる。HCVtcpを、多くの株を用いて作製する事が可能となり、パントロピック中和活性を有するモノクローナル抗体を見いだした。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201227011B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ウイルス性肝炎に対する治療ワクチンの開発に関する研究
• 課題番号: H22-肝炎-一般-011
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 小原 道法(公益財団法人東京都医学総合研究所 ゲノム医科学研究分野)

研究分担者(所属機関)

• 保富　康宏(独立行政法人医薬基盤研究所　霊長類医科学研究センター)
• 瀬谷　司(北海道大学大学院・先端生命科学研究院)
• 鈴木　亮介(国立感染症研究所ウイルス第二部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 肝炎等克服緊急対策研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　C型肝炎ウイルス(HCV)感染者に対するインターフェロン治療は副作用等の問題も大きい。他方で、HCVは感染することにより80％の被感染者が慢性化してしまうが、20％は慢性化せず自己の免疫によりウイルスを排除する。また、HBVに関しては、慢性化した成人において増悪化を契機に自己の免疫により排除する例が知られている。これらのことは、免疫を賦活化することによりウイルスのコントロールができる可能性を示唆している。そこで本研究ではHCV及びHBV特異的免疫賦活化による根治を目指した治療的ワクチンの開発を目的とする。

研究方法

Cre/loxPシステムでHCV遺伝子を導入したトランスジェニックマウス(Tgマウス)を作製し、任意の時期にHCV遺伝子（CN2-NS2）をスイッチング発現するTgマウスを作製した。HCV蛋白質発現後３-6ヶ月後にはC型慢性肝炎の病態（肝臓の索状構造の乱れ、脂肪化、グリコーゲンの蓄積、繊維化）を発症した。HCVN25-RVV を慢性肝炎状態のHCV/Cre-Tgに接種し、HCV排除及びその作用機序を解析した。さらに、炎症性サイトカインの定量、肝臓、脾臓リンパ球での抗原特異的CTLsの検出などの解析を行った。慢性肝炎の病態形成にTNF-a, IL-6の関与が示唆されたため、炎症性単球M１マクロファージ（M1Mφ）やM2マクロファージ（M2Mφ）の分布変化について解析した。
HCV遺伝子発現DNAワクチンを作製し、慢性肝炎状態のHCV/Cre-Tgに接種し、HCV蛋白質の排除及びその作用機序を解析した。
複数の遺伝子型／株由来のHCVの遺伝子配列を用い、HCVtcpを作製した。HCVtcpとHCVpp、HCVccについて、Huh7.5.1細胞への感染における抗CD81抗体および抗ApoE抗体の影響を調べた。さらにHCVのE1およびE2に反応するマウスモノクローナル抗体およびウサギ抗血清についての感染中和活性を評価した。

結果と考察

慢性肝炎状態のHCV-Tgマウスに組換えワクチンｒVV-N25を単回皮内接種し、接種後1週のTgマウス肝臓では各接種群でＨＣＶ蛋白の減少が認められなかったが、４週ではN25接種群が減少していた。またN25接種群では接種後1週で肝臓の索状構造や肝細胞のsteatosisなど、HCV特有の形態学的な異常の正常化が認められた。
HCV遺伝子発現DNA（HCV-DNA）ワクチンの作製:各種HCV-DNAワクチン（HCV-CN2、HCV-N25、empty）を作製した。HCV-CN2,HCV-N25のDNAワクチン共にCD8+、CD4+細胞でHCV抗原特異的IFN-γの産生が認められた。また、肝臓の形態学的検索を行ったところ、HCV-N25投与群において肝臓組織の異常が改善されることを確認した。以上のことからHCV-rVV及びHCV-DNAワクチンはＨＣＶの排除及び肝炎抑制を目指した安全で効果的な治療ワクチンの開発が期待される。今後さらに投与方法などの検討を行いたい。
また、遺伝子型1a、1b、2a、3a由来の構造蛋白質を用いたHCVtcpの産生が認められた。抗CD81抗体はHCVtcp、HCVppおよびHCVccの感染を中和したが、HCVtcpとHCVccは HCVppに比べて著しく高い感受性を示した。HCVのE1およびE2に反応するマウスモノクローナル抗体およびウサギ抗血清について感染中和活性を評価した結果、中和活性を持つモノクローナル抗体を見いだした。このモノクローナル抗体は、遺伝子型の異なる複数の株のHCVtcpに対しても中和活性を示した。

結論

　Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子組換えワクチン及びDNAワクチンで効果が認められたので、さらに、細胞内免疫活性化剤や構築したHCV-DNAワクチンを併用することで治療効果増強法の検討、抗体価の測定や細胞性免疫応答の解析を行った。HCVの非構造蛋白領域を発現するDNAワクチン（HCV-N25）はC型肝炎モデルマウスを用いた実験の結果より、治療用ワクチンとして有用である可能性が示された。HCV-TgマウスにおけるHCVに対する免疫抑制機構についての解析が進めば、さらにHCV-N25の効果を増強することが期待できる。HCVtcpを、多くの株を用いて作製する事が可能となり、パントロピック中和活性を有するモノクローナル抗体を見いだした。今後パントロピック中和抗体を産生するワクチンの構築を目指す。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201227011C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 肝臓内の炎症性サイトカインは主にマクロファージ(Mφ)が産生しており、慢性肝炎マウスの肝臓内では一般的な急性炎症部位で多く見られるM1Mφではなく、慢性炎症部位に見られる炎症性サイトカイン（IL-6, TNFa）を発現するM2Mφが優位に存在していた。HCV-TgマウスのHCV抗原特異的IFN-γ産生能は減弱しており、HCV蛋白が発現することで免疫抑制の状態になり、強い細胞性免疫が誘導できていないことが考えられた。これらの機構が解明されれば、強力な治療用ワクチン開発に繋がることが考えられる。
• 臨床的観点からの成果: C型慢性肝炎の病態（脂肪化、グリコーゲンの蓄積、繊維化等）を発症するHCV/Cre-トランスジェニックマウスにＣ型肝炎ウイルス遺伝子組換えワクチンHCVN25-RVVを接種したところ治療効果が認められた。また、HCV-DNAワクチンをC57BL/6マウスに免疫したところ、HCVに対する強いCTLの誘導が認められた。C型肝炎モデルマウスにHCVN25-RVVワクチンを投与したところ、肝臓中のHCVコア蛋白発現量が有意に減少し、治療用ワクチンとして有用である可能性が示唆された。
• ガイドライン等の開発: 該当なし
• その他行政的観点からの成果: 該当なし
• その他のインパクト: 該当なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 9件
• 原著論文（英文等）: 80件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 41件
• 学会発表(国際学会等): 63件
• その他成果(特許の出願): 4件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: 肝線維症の予防または治療剤
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2012-270987 ; 発明者名: 小原道法、小田上剛直、小路弘行 ; 権利者名: 公益財団法人東京都医学総合研究所、株式会社PRISM Pharma ; 出願年月日: 20121212 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 新規組換え型ヒトＣ型肝炎ウイルス様粒子とその産生方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 1930416 ; 発明者名: 脇田隆字、石井孝司、鈴木哲朗、鈴木亮介、宮村達男、田邉純一、曽根三郎 ; 権利者名: 国立感染症研究所、財）東京都医学研究機構、東レ株式会社 ; 国内外の別: EP

• 特許の名称: Ｃ型肝炎ウイルス粒子高生産系
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 1956087 ; 発明者名: 脇田隆字、石井孝司、鈴木哲朗、鈴木亮介、宮村達男、田邉純一、曽根三郎 ; 権利者名: 国立感染症研究所、財）東京都医学研究機構、東レ株式会社 ; 出願年月日: 20110831 ; 国内外の別: EP

• 特許の名称: 難治性ウイルス感染症の治療剤
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2010-202355 ; 発明者名: 小原道法、中川慎一郎 ; 権利者名: 東京都医学研究機構 ; 出願年月日: 20100909 ; 国内外の別: 国内

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Shin-ichiro Nakagawa, Yuichi Hirata, Takeshi Kameyama, et al.; Targeted induction of interferon-λ in humanized chimeric mouse liver abrogates hepatotropic virus infection; PLoSONE , 8 (3) , e59611- (2013); 10.1371/journal.pone.0059611
• 原著論文2: Fumihiko Yasui, Masayuki Sudoh, Masaaki Arai, et al.; Synthetic lipophilic antioxidant BO-653 suppresses HCV replication; J. Med. Virol , 85 (2) , 241-249 (2013); 10.1002/jmv.23466
• 原著論文3: Satoshi Sekiguchi, Kiminori Kimura, Tomoko Chiyo,et al.; Immunization with a recombinant vaccinia virus that encodes nonstructural proteins of the hepatitis C virus suppresses viral protein levels in mouse liver; PLoSONE , 7 (12) , e51656- (2012); 10.1371/journal.pone.0051656
• 原著論文4: Kazuaki Inoue, Kyoko Tsukiyama-Kohara, Chiho Matsuda et al.; Impairment of interferon regulatory factor-1 3 activation by hepatitis C virus core protein basic region 1; Biochem Biophys Res Commun. , 428 (4) , 494-499 (2012); 10.1016/j.bbrc.2012.10.079
• 原著論文5: Yuichi Hirata, Kazutaka Ikeda, Masayuki Sudoh et al.; Self-enhancement of Hepatitis C Virus Replication by Promotion of Specific Sphingolipid Biosynthesis; PLoS Pathog , 8 (8) , e1002860- (2012); 10.1371/journal.ppat.1002860
• 原著論文6: Yuri Kasama, Makoto Saito, Takashi Takano,; Translocase of outer mitochondrial membrane 70 induces interferon response and is impaired by hepatitis C virus NS3; Virus Res. , 163 (1) , 405-409 (2012); 10.1016/j.virusres.2011.10.009
• 原著論文7: Shime H, Matsumoto M, Oshiumi H et al.; Toll-like receptor 3 signaling converts tumor-supporting myeloid cells to tumoricidal effectors; Proc Natl Acad Sci U S A. , 109 (6) , 2066-2071 (2012); 10.1073/pnas.1113099109
• 原著論文8: Yamazaki S, Maruyama A, Okada K,et al.; Dendritic cells from oral cavity induce Foxp3(+) regulatory T cells upon antigen stimulation; PLoS One. , 7 (12) , e51665.- (2012); 10.1371/journal.pone.0051665
• 原著論文9: Tajiri,K., Imanaka-Yoshida,K.,Matsubara,A.et al. ; Suppressor of cytokine signaling 1 DNA administration inhibits inflammatory and pathogenic responses in autoimmune myocarditis; J Immunol. , 189 (4) , 2043-2053 (2012); 10.4049/jimmunol.1103610
• 原著論文10: Suzuki R, Saito K, Kato T,et al.; Trans-complemented hepatitis C virus particles as a versatile tool for study of virus assembly and infection.; Virology , 432 (1) , 29-38 (2012); 10.1016/j.virol.2012.05.033
• 原著論文11: Masaaki Satoh, Makoto Saito, Takashi Takano,et al.; Monoclonal antibody 2-152a suppresses hepatitis C virus infection through betaine/GABA transporter-1; J Infect Dis. , 204 (8) , 1172-1180 (2011); 10.1093/infdis/jir501
• 原著論文12: Tomoko Chiyo, Satoshi Sekiguchi, Masahiro Hayashi,et al.; Conditional gene expression in hepatitis C virus transgenic mice without induction of severe liver injury using a non-inflammatory Cre-expressing adenovirus.; Virus Res. , 160 (1) , 89-97 (2011); 10.1016/j.virusres.2011.05.019
• 原著論文13: Takashi Takano, Kyoko Tsukiyama-Kohara, Masahiro Hayashi,et al.; Augmentation of DHCR24 expression by hepatitis C virus infection facilitates viral replication in hepatocytes; J Hepatol. , 55 (3) , 512-521 (2011); 10.1016/j.jhep.2010.12.011
• 原著論文14: Takashi Takano, Michinori Kohara, Yuri Kasama,et al.; Translocase of outer mitochondrial membrane 70 expression is induced by hepatitis C virus and is related to the apoptotic response.; J Med Virol. , 83 (5) , 801-809 (2011); 10.1002/jmv.22046
• 原著論文15: Takaki H, Watanabe Y, Shingai M. et al.; Strain-to-strain difference of V protein of measles virus affects MDA5-mediated IFN-β-inducing potential; Mol Immunol. , 48 (4) , 497-504 (2011); 10.1016/j.molimm.2010.10.006
• 原著論文16: Sawahata R, Shime H, Yamazaki S, et al.; Failure of mycoplasma lipoprotein MALP-2 to induce NK cell activation through dendritic cell TLR2; Microbes Infect. , 13 (4) , 350-358 (2011); 10.1016/j.micinf.2010.12.003
• 原著論文17: Oshiumi H, Okamoto M, Fujii K et al.; The TLR3/TICAM-1 pathway is mandatory for innate immune responses to poliovirus infection.; J Immunol. , 187 (10) , 5320-5327 (2011); 10.4049/jimmunol.1101503
• 原著論文18: Ebihara T, Azuma M, Oshiumi H, Kasamatsu J,et al.; dentification of a polyI:C-inducible membrane protein that participates in dendritic cell-mediated natural killer cell activation.; J Exp Med. , 207 (12) , 2675-2687 (2010); 10.1084/jem.20091573
• 原著論文19: Hideko Nuriya, Kazuaki Inoue, Takeshi Tanaka et al. ; Detection of hepatitis B and C viruses in almost all hepatocytes by modified PCR-based in situ hybridization.; J Clin Microbiol. , 48 (11) , 3843-3851 (2010); 10.1128/JCM.00415-10
• 原著論文20: Yutaka Amako, Kyoko Tsukiyama-Kohara, Asao Katsume,et al.; Pathogenesis of hepatitis C virus infection in Tupaia belangeri.; J Virol. , 84 (1) , 303-311 (2010); 10.1128/JVI.01448-09

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201227011Z