抗菌剤治療により寛解する難治性炎症性腸疾患患者の網羅的細菌叢解析と病因・増悪因子細菌群の解明

文献情報

• 文献番号: 201225022A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 抗菌剤治療により寛解する難治性炎症性腸疾患患者の網羅的細菌叢解析と病因・増悪因子細菌群の解明
• 課題番号: H22-新興-若手-019
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 黒田 誠(国立感染症研究所 病原体ゲノム解析研究センター)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 1,647,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

難治性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎（UC）は、個有の遺伝的背景と腸内細菌叢が密接に関連して発症する事が示唆されている。三種の抗菌剤ATM（アモキシシリン／テトラサイクリン／メトロニダゾール）を二週間投薬するだけで、その疾患が１年以上緩解することが明らかとなってきた。本研究は、UC発症の環境要因となる細菌叢を抗菌剤治療前後で網羅的且つ定量的に解析を行い、本疾患と密接に関連する細菌の探索を行い、本疾患の発症機序を環境要因の側から理解することを目的とする。

研究方法

平成２３年度に引き続き、AFM治療を施したUC患者６名の治療前後における自然排泄便を得た（研究協力者：大草敏史：東京慈恵会医科大・柏病院）。
糞便懸濁液を溶菌酵素（lysozymeとachromopeptidaseの混合）にて溶菌処理を施し、QIAGEN DNA stool kitを用いてDNA精製した。NEXTERA sample prep kitを用いてメタゲノムDNAライブラリーを作製した。それぞれIllumina GAIIxを用いて平均1000万本の配列を解読し、細菌種鑑別に有効な配列対象を検討した。解読リードをmegablast相同性検索により細菌種を鑑別した。配列検索に使用したデータベースはNCBI non-redundant ntデータベースを用いた。MEGAN ver4.7 を用いて細菌種の分類を行い、該当する細菌の解読リード本数から検出率を算出した。統計的にUC発症に関連する細菌群を抽出するために、LEfSe 統計処理(Segata. et al, Genome Biol. 12, R60, 2011)を用いた。

結果と考察

１）AFM治療前後で有意に検出される腸内細菌の同定
　AFM治療を受けたUC患者６名の自然排泄便のメタゲノム解析を行った。サンプルあたり、300万本～3000万本の解読リードを得た。塩基レベルで相同性解析した結果を細菌属レベルで分類した（図２）。一見してAFM治療前の発症時には大腸菌Escherichia coli の検出率が高く、UC患者６名のうち患者B以外の５名から検出された。AFM治療により患者D以外の４名で検出率が大幅に減少し、AFM治療効果とUC寛解との関係性が示唆された。
　統計的に有意にUC発症に関連する細菌群を抽出するために、LEfSe 統計処理(Segata. et al, Genome Biol. 12, R60, 2011)を用いた（図３）。Non-parametric検定とLinear discriminant analysisによる統計解析法であり、群間で共通して変動する因子を特定する統計手法である。今回、AFM治療前後の２群比較において、症状に起因する腸内細菌群を同定するために使用した。LEfSe法により、６名の抗菌薬AFM治療の前後で、大腸菌Escherichia coli　 が有意に検出された。
　LEfSe解析結果から大腸菌E. coliのみを抽出して表示した。６名中４名で大腸菌E. coliは治療前において有意な存在量を示し、潰瘍性大腸炎に何らかの要因となっている可能性が示唆された。

結論

昨年度（H23年度）の成果で、ATM治療前の急性期便から大量に大腸菌が検出される患者がおり、ATM治療において健常な腸内細菌フローラに近づきつつ有ることを示した。本年度は６名のUC患者の自然排泄便を検体にして AFM治療前後の腸内細菌フローラを解析し、昨年度と同様に大腸菌が有意に検出率され、UC発症になんらかの因果関係を示唆するデータを得た。
　大腸粘膜のびらん炎症像が示すように、UC発症時は通常の細菌フローラでは無いだろうと感じていたが、ある固有の大腸菌株が過剰に増殖しており、ある単一の細菌種に固定されてしまって多様性を失っていることが分かった。想定通り特有の細菌が過剰に増殖した結果、UCの増悪に関連していることが示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-05-31
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201225022B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 抗菌剤治療により寛解する難治性炎症性腸疾患患者の網羅的細菌叢解析と病因・増悪因子細菌群の解明
• 課題番号: H22-新興-若手-019
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 黒田 誠(国立感染症研究所 病原体ゲノム解析研究センター)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　難治性腸疾患、特に潰瘍性大腸炎（UC）は、個有の遺伝的背景と腸内細菌叢が密接に関連して発症する事が示唆されている。三種の抗菌剤（ATM: アモキシシリン／テトラサイクリン／メトロニダゾール）を二週間投薬するだけで、その疾患が１年以上緩解する治療例が報告されている。しかしながら、その患者腸管内の膨大な細菌叢の中で、どの細菌が最もその疾患と相関するのかは不明である。本研究は、UC発症の環境要因となる細菌叢を抗菌剤治療前後で網羅的且つ定量的に解析を行い、本疾患と密接に関連する細菌の探索を行い、本疾患の発症機序を環境要因の側から理解することを目的とする。
　

研究方法

これまでに、UC患者の腸内細菌叢は、T-RFLP、定量PCR、16S rDNAのシークエンス等の手法で解析されてきた。しかしながら、上記手法は網羅性もしくは定量性のどちらかに特化しており、密接に関連する菌種の特定に至らず、より網羅的且つ定量的解析が必要となる。細菌叢の新解析手法として、パイロシークエンス法による次世代シークエンサーが用いられているが、コストが高いのが難点である。本研究課題により、Illumina社の次世代シークエンサーを用いて糞便中のminor group（1x103～4cfu/1g）の細菌の検出も可能な、簡便で安価、網羅的且つ定量的解析手法を開発した。
　UC患者２名（UC266875, UC-267223）の発症時およびATM治療後の寛解時の排泄便を得て（研究協力者：寺尾修一先生・加古川東市民病院）、便検体に内在する細菌フローラを16S-rDNA解読法とメタゲノミクス法にて同定・分類し比較検討した。

結果と考察

得られた細菌の解読リードを細菌属レベルで分類したところ、寛解維持に伴い腸内環境を改善するBifidobacterium, Faecalibacteriumの増加が顕著であり、腸内フローラが健常に近づきつつあると示唆された。一方、患者２名の発症時の様子は異なっており、Escherichia, Ruminococcus、Leuconostoc, Bacteroidesの検出が顕著であった。
　平成23年度はUC患者２名の発症時およびATM治療後の寛解時の排泄便を得て便検体に内在する細菌フローラを16S-rDNA解読法とメタゲノミクス法にて同定・分類し比較検討した。平成24年度はATM治療に代わり AFM (アモキシシリン／フォスフォマイシン／メトロニダゾール)治療を受けたUC患者６名の治療前後の腸内フローラ解析を行った。メタゲノム解析と LEfSe法による統計解析にてAFM治療前後で大腸菌が有意に検出され、昨年度のATM治療患者と類似した結果が得られた。大腸菌の中でも具体的な病原性を示す大腸菌系統であるかどうか、ゲノムワイド塩基多型にて系統分類した結果、食中毒で頻繁に検出される大腸菌とは異なり、ある特有の偏った大腸菌系統株が増殖しやすい環境であることが示唆された。AFM治療によって健常時のような多様な系統の大腸菌群が検出されていることから、菌叢の多様性がUC寛解に貢献しているものと推察された。

結論

　コッホの４原則に適合する感染症は、その病原体が培養可能であり、且つ感染実験系が確立している為、その理解がし易い。しかしながら、その原則に当てはまらない培養不可能な病原体、および、病原性は低いが数種の要因で疾患を呈するものに関する理解は進んでいない。この様な、新たに提唱可能な新興感染症となりうる病原体の理解は、今後更に重要となる。また、難治性疾患であるUCは、上記のような新興感染症の可能性が強く示唆されるため、感染症と難治性疾患との関係をより詳細に理解する為の研究が必要不可欠となる。
　本研究課題は近年発症患者数が増加の一途を辿るUCの発症機序を腸内細菌叢側から理解することを目的としている。本年度は６名のUC患者のAFM治療前後の排泄便からUC発症に関連する細菌の同定を試みた。UC発症時は大腸菌などが優勢に検出され、dysbiosis といわれる健常バランスが乱れた腸内細菌フローラになっていることを明らかにした。得られた研究結果は、日本国内のみならず、全世界の本疾の予防、患者の治療、更にはその診断に重要な知見を提供できると考えている。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-05-31
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201225022C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: AFM (アモキシシリン／フォスフォマイシン／メトロニダゾール)治療前で大腸菌が有意に検出された。大腸菌の中でも具体的な病原性を示す大腸菌系統であるかどうか、ゲノムワイド塩基多型にて系統分類した結果、食中毒で頻繁に検出される大腸菌とは異なり、ある特有の偏った大腸菌系統株が増殖しやすい環境であることが示唆された。AFM治療によって健常時のような多様な系統の大腸菌群が検出されていることから、菌叢の多様性が寛解に貢献しているものと推察された。
• 臨床的観点からの成果: 本研究課題は近年発症患者数が増加の一途を辿る潰瘍性大腸炎の発症機序を腸内細菌叢側から理解することを目的としている。発症時は大腸菌などが優勢に検出され、dysbiosis といわれる健常バランスが乱れた腸内細菌フローラになっていることを明らかにした。得られた研究結果は、日本国内のみならず、全世界の本疾の予防、患者の治療、更にはその診断に重要な知見を提供できると考えている。
• ガイドライン等の開発: 該当なし。
• その他行政的観点からの成果: 該当なし。
• その他のインパクト: 該当なし。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 0件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 1件
• 学会発表(国際学会等): 2件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

公開日・更新日

• 公開日: 2016-06-27
• 更新日: 2017-05-24

収支報告書

• 文献番号: 201225022Z