重症呼吸器ウイルス感染症のサーベイランス・病態解明及び制御に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201225011A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 重症呼吸器ウイルス感染症のサーベイランス・病態解明及び制御に関する研究
• 課題番号: H22-新興-一般-011
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 木村 博一(国立感染症研究所 感染症情報センター)

研究分担者(所属機関)

• 小沢　邦寿(群馬県衛生環境研究所)
• 調　恒明(山口県環境保健センター)
• 竹田　誠(国立感染症研究所　ウイルス第三部)
• 野田　雅博(国立感染症研究所　感染症情報センター)
• 松山　州徳(国立感染症研究所　ウイルス第三部)
• 水谷　哲也(東京農工大学農学部附属国際家畜感染症防疫研究教育センター　伝染病疫学解明部門)
• 黒田　誠(国立感染症研究所　病原体ゲノム解析研究センター)
• 岡山　吉道(日本大学　医学部)
• 梁　明秀(横浜市立大学　医学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 33,497,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本邦において、重症呼吸器感染症による年間死亡者数は推定で10万人を超えていることが推定される。これらの症例の中に、少なからず呼吸器ウイルスが関与していることが推定されるが、その実態は不明である。また、市中肺炎以外については、呼吸器感染症の重症度の指標は定まっていない。このような背景から、重症例を含む呼吸器ウイルス感染症の包括的なウイルスサーベイランス、臨床的な重症度の指標化、重症化の病態解明および効果的なワクチン開発も視野に入れた研究は重要でかつ必要性が極めて高いと思われる。本研究においては、国内の呼吸器ウイルス感染症のサーベイランス、病態解明および制御の拠点である全国地方衛生研究所、大学医学部・大学病院および国立感染症研究所により以下の内容の研究を行った。

研究方法

1)包括的な重症急性呼吸器感染症のウイルスサーベイランスに関する研究を行った。2)小児科領域の呼吸器ウイルス感染症の重症度を簡便に救急の現場でも把握できるよう、多呼吸、喘鳴、陥没呼吸、酸素需要、哺乳障害の5項目について指標化を行った。3)成人領域における重症度の指標化を行った。4)次世代シークエンサーによる解読リードを病院・地方衛生研究所等でも情報解析できるよう、ネットワーク経由で病原体鑑別するための情報解析パイプラインを構築した。5)新型コロナウイルス(HCoV-EMC/2012)のリアルタイムRT-PCR法による検査診断法の開発・検査診断マニュアル・標準物質(陽性コントロールなど)を作成し、全国衛生研究所における当該ウイルス検査診断体制の確立・普及を行った。6)パラミクソウイルス・コロナウイルスの感染機序解明に関する研究を行った。7)ライノウイルス（HRV）感染ヒト肺線維芽細胞(MRC-5細胞)が産生するサイトカインのプロファイリング、シグナル伝達機構解明およびコルチコステロイドの効果に関する研究を行った。8)HPIV3感染症に対し、コムギ無細胞タンパク質合成系を用いたhPIV3外被タンパク質hemagglutinin-neuraminidase（PIV3-HN）を合成し、マンノース被覆リポソームと組み合わせた新しいワクチンの開発を行った。また、HN全長タンパク質を抗原としたモノクローナル抗体作製を試みた。

結果と考察

1)ARIs症例検体からARIsウイルス検索を試みた結果、Respiratory Syncytialウイルス(RSV)、ヒトメタニューモウイルス(HMPV)、ヒトライノウイルス(HRV)、ヒトパラインフルエンザウイルス(HPIV)等が本疾患へ強く関与していることを明らかにした。2)小児科領域の呼吸器ウイルス感染症の重症度は、0-1項目は軽症、2-3項目は中等症、4-5項目は重症とすることが適切であると示唆された。3)成人領域における重症度の指標は、入院後の昇圧剤使用、人工呼吸器使用および予後を考慮すべきと考えられた。4)次世代シークエンサーを用い、重症呼吸器感染症の網羅的解析を実施した結果、地方衛生研究所において次世代型シークエンサーを基盤とした種々の呼吸器ウイルス網羅解析法の確立に成功した。5)HN全長タンパク質を抗原としたモノクローナル抗体の作製に成功した。6)HRV感染MRC-5細胞は、種々の炎症性サイトカイン、Th2サイトカインや気道リモデリングに関連するサイトカインを多量に産生することが明らかになった。

結論

1)RSV、HMPV、HRV、HPIV、HBoV、HCoVおよびEV68などの急性呼吸器ウイルス感染症への関与および分子疫学が明らかになった。2) 重症呼吸器ウイルス感染症の実態調査および重症度の臨床的な指標化が可能になった。3)重症呼吸器ウイルス感染症のサイトカイン、シグナル伝達機構およびコルチコステロイドのサイトカイン産生抑制効果が明らかになった。4)ヒトパラミクソウイルスおよびヒトコロナウイルスの感染機序が明らかになった。5)新型コロナウイルス(CoV-EMC/2012)の検査診断法の確立・普及により、全国衛生研究所において当該ウイルスの検査診断が可能になった。6)次世代シークエンサーの活用により、不明呼吸器疾患ウイルスの解析が可能になった。7) HPIV3のHN抗原に対する防御抗体産生機構が明らかになるとともにこの抗原を用いたマンノース・リポソームワクチン候補の作成に成功した。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-06-05
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201225011B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 重症呼吸器ウイルス感染症のサーベイランス・病態解明及び制御に関する研究
• 課題番号: H22-新興-一般-011
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 木村 博一(国立感染症研究所 感染症情報センター)

研究分担者(所属機関)

• 小澤　邦壽(群馬県衛生環境研究所)
• 調　恒明(山口県環境保健センター)
• 竹田　誠(国立感染症研究所　ウイルス第三部)
• 野田　雅博(国立感染症研究所　感染症情報センター)
• 松山　州徳(国立感染症研究所　ウイルス第三部)
• 水谷　哲也(東京医農工大学農学部付属国際家畜感染症防疫研究教育センター伝染病疫学解明部門)
• 黒田　誠(国立感染症研究所　病原体ゲノム解析研究センター)
• 岡山　吉道(日本大学医学部)
• 梁　明秀(横浜市立大学医学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

ほとんどの呼吸器ウイルスは、気管支炎や肺炎などの重症感染症を引き起こすが、本邦においては、重症呼吸器ウイルス感染症の実態及び病態はよくわかっていない。また、これらのウイルスに対するワクチン開発もほとんどなされていない。そこで、本研究は、重症呼吸器ウイルス感染症における包括的なウイルスサーベイランス、重症化の病態解明およびワクチン開発を目的とした研究を行った。

研究方法

1)各地にて感染症発生動向調査等により収集された検体から呼吸器ウイルス分離・検出・遺伝学的解析を実施した。2)全国77カ所の地方衛生研究所等を対象としたsvARIに関するアンケート調査を実施した。3)小児科および成人領域における市中肺炎以外の重症呼吸器ウイルス感染症の臨床的な指標化および実態調査を行った。4)HPIV3およびRSV感染MRC-5細胞によって惹起されるサイトカインならびにサイトカイン産生に関与するシグナル伝達機構をマルチアレイビーズ法によりそれらの網羅解析を行った。5)HPIV1-3のF蛋白を活性化するプロテアーゼを明らかにするとともに、GFPを組み込んだこれらのウイルスの増殖機構をプラーク法、GFPから発する蛍光解析によって解析した。6)VSVシュードタイプウイルスに、コロナウイルス（SARS、NL63、229Eおよび229Eの臨床分離株）のS蛋白をもたせ、細胞侵入実験に用いた。7)ベクターpEU-E01-GST-PIV3HNを構築し、コムギ無細胞タンパク質合成系を用い、抗原となるPIV-3-HNタンパク質全長タンパク質の合成を行った。タンパク精製はグルタチオンビーズによるカラム法を用いた。8)正常細胞の不死化を誘導するレンチウイルスベクターとしてpLenti6_TERT, pLenti6_HPV16-E7, pLenti6_sh-p16_TetOff_FRT-GFP-BSDを作成し、MRC-5/TERT細胞に不死化誘導因子を導入した。

結果と考察

1)全国各地において、ウイルスサーベイランスを行った結果、RSV、HMPV、HRV、HPIV、HCoV、EV、SAFVおよびHBoVなどが検出された。2)77地研のうち、69施設から回答が得られた（回答率 89.6％）。重症化に関与が示唆されたウイルスは、InfV、RSVおよびHMPVなどであった。3) 小児科領域の呼吸器ウイルス感染症の重症度は、0-1項目は軽症、2-3項目は中等症、4-5項目は重症とすることが適切であると示唆された。3)成人領域における重症度の指標は、入院後の昇圧剤使用、人工呼吸器使用および予後を考慮すべきと考えられた。4)HPIV-3およびRSV感染により、種々のサイトカインが産生された。また、これらのサイトカイン産生には、IB,および p38 MAPKのリン酸化が関与することが示唆された。5)HPIV-1型09-2130株、HPIV-2型08-1869株ならびにHPIV-33型09-1547株は、Vero細胞でトリプシン非依存的に多段階増殖し、Vero細胞に多核巨細胞形成を伴う強い細胞変性（CPE）を引き起こした。6)SARS とNL63のシュードタイプウイルスのTMPRSS2発現細胞感染価は非発現細胞と比較して、有意に高くなっていた。7)合成したGST融合PIV3-HNタンパク質を、グルタチオンセファロースビーズによるカラム法を用いて精製、TEVプロテアーゼを用いGSTタグを切断した。その結果、PV3-HNタンパク質の可溶性が顕著に低下した。8)ウイルスベクターをMRC-5/TERT細胞に感染させ長期培養を行った結果、少なくとも100回以上の分裂が可能な3株の不死化MRC-5細胞の誘導に成功した。

結論

1) RSV、HMPV、HRV、HPIV、HBoVおよびHCoV等、多数のウイルスが、急性呼吸器ウイルス感染症および重症化に関与していることが示唆された。2)市中肺炎以外の 重症呼吸器ウイルス感染症の定義について、その実態および原因となる病原体をさらに明らかにすることが必要であることが示唆された。3) HPIV-3とRSVによるサイトカイン産生とバランスの不均衡が、部分的にではあるが種々の合併症に関与していることが示唆された。4) HPIV1-3型がTMPRSS2を用いて多段階増殖可能であることが示唆された。5) HCoVは肺特異的プロテアーゼTMPRSS2を利用して細胞に侵入することが明らかになった。6) PIV-3ワクチン開発に向け、コムギ無細胞系を用いたリコンビナントウイルス外被タンパク質（PIV-3-HN）のベクター構築および機能的タンパク質の大量精製に成功した。7)不死化MRC-5細胞は、種々の呼吸器ウイルスの分離に有用であることが示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-06-05
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201225011C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 重症呼吸器ウイルス感染症の国内サーベイランス及び実態調査によって、重症化に関与するウイルスの分子疫学が明らかになる。また、ウイルス検査法の開発・標準化により、国内の主な呼吸器ウイルス分析・解析機関(感染研、衛生研究所)での検査が円滑に行えると同時に得られたウイルス遺伝子のデータベース等の共有化が可能になる。また、地方衛生研究所における新型コロナウイルスの検査診断法及び検査体制の確立が可能になる。
• 臨床的観点からの成果: 呼吸器ウイルス感染症に生じるサイトカインストームに関する病態が明らかになる。さらに、ワクチン未開発あるいは開発を断念した主要な呼吸器ウイルス(パラインフルエンザウイルスなど)に対するワクチンや抗ウイルス薬の開発に資することも期待される。
• ガイドライン等の開発: 1)新型コロナウイルス(HCoV-EMC/2012)検査診断マニュアル(全国地方衛生協議会・国立感染症研究所編)2)RSウイルス検査診断マニュアル(全国地方衛生協議会・国立感染症研究所編)3)パラインフルエンザウイルス検査診断マニュアル(全国地方衛生協議会・国立感染症研究所編)4)ヒトライノウイルス検査診断マニュアル(全国地方衛生協議会・国立感染症研究所編)5)ヒトボカウイルス検査診断マニュアル(全国地方衛生協議会・国立感染症研究所編)
• その他行政的観点からの成果: 新型コロナウイルス(HCoV-EMC/2012)の出現に備え、全国衛生研究所で当該ウイルスの検査診断が円滑に行えるよう、検査マニュアルの配布および検査診断に必要な試薬などを配布した。
• その他のインパクト: 特になし。

発表件数

• 原著論文（和文）: 6件
• 原著論文（英文等）: 70件
• その他論文(和文): 28件
• その他論文(英文等): 2件
• 学会発表(国内学会): 28件
• 学会発表(国際学会等): 3件
• その他成果(特許の出願): 1件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 1件 ; 新型コロナウイルス(HCoV-EMV/2012)検査診断マニュアルの作成配布を行った
• その他成果(普及・啓発活動): 5件 ; 5編の病原体検査診断マニュアル（地研協議会・感染研編）を作成した。

特許

• 特許の名称: 幹細胞の安定性維持、複製を制御するためのペプチジルプロリルイソメラーゼPin1の利用
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 2010-238548 ; 発明者名: 梁明秀、西真由子 ; 権利者名: 公立大学法人横浜市立大学 ; 出願年月日: 20101025

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Kiyota N, Kushibuchi I, Kobayashi M,et al.; Genetic analysis of the VP4/VP2 coding region in human rhinovirus species C in patients with acute respiratory infection in Japan.; J Med Microbiol. , 62 (4) , 610-617 (2013)
• 原著論文2: Seki E, Yoshizumi M, Tanaka R,et al.; Cytokine profiles, signalling pathways and effects of fluticasone propionate in respiratory syncytial virus-infected human foetal lung fibroblasts.; Cell Biol Int. (2013)
• 原著論文3: Kobayashi M, Tsukagoshi H, Ishioka T,et al.; Seroepidemiology of Saffold cardiovirus (SAFV) genotype 3 in Japan.; J Infect. , 66 (2) , 191-193 (2013)
• 原著論文4: Saitoh M, Takeda M, Gotoh K, et al.; Molecular evolution of hemagglutinin (H) gene in measles virus genotypes D3, D5, D9, and H1.; PLoS One. , 7 (11) , 50660- (2012)
• 原著論文5: Mizuta K, Abiko C, Aoki Y,et al.; Epidemiology of parainfluenza virus types 1, 2 and 3 infections based on virus isolation between 2002 and 2011 in Yamagata, Japan.; Microbiol Immunol. , 56 (12) , 855-858 (2012)
• 原著論文6: Mizuta K, Kuroda M, Kurimura M,et al.; Epidemic myalgia in adults associated with human parechovirus type 3 infection, Yamagata, Japan, 2008.; Emerg Infect Dis. , 18 (11) , 1787-1793 (2012)
• 原著論文7: Nidaira M, Taira K, Hamabata H,et al.; Molecular epidemiology of human metapneumovirus from 2009 to 2011 in Okinawa, Japan.; Jpn J Infect Dis. , 65 (4) , 337-340 (2012)
• 原著論文8: Yoshida A, Kiyota N, Kobayashi M,et al.; Molecular epidemiology of the attachment glycoprotein (G) gene in respiratory syncytial virus in children with acute respiratory infection in Japan in 2009/2010.; J Med Microbiol. , 61 , 820-829 (2012)
• 原著論文9: Ikeda T,Mizuta K,Abiko C,et al.; Acute respiratory infections due to enterovirus 68,in Yamagata,Japan between 2005 and 2010.; Microbiol Immunol. , 56 (2) , 139-143 (2012)
• 原著論文10: Arakawa M, Okamoto-Nakagawa R, Toda S,et al.; Molecular epidemiological study of human rhinovirus species A, B and C from patients with acute respiratory illnesses in Japan.; J Med Microbiol. , 61 , 410-419 (2012)
• 原著論文11: Mizuta K, Saitoh M, Kobayashi M,et al.; Detailed genetic analysis of hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein gene in human parainfluenza virus type 1 isolates from patients with acute respiratory infection between 2002 and 2009 in Yamagata prefecture, Japan.; Virol J. , 8 , 533- (2011)
• 原著論文12: Tsukagoshi H, Mizuta K, Abiko C, et al.; The impact of Saffold cardiovirus in patients with acute respiratory infections in Yamagata, Japan.; Scand J Infect Dis. , 43 (8) , 669-671 (2011)
• 原著論文13: Fujitsuka A, Tsukagoshi H, Arakawa M,et al.; A molecular epidemiological study of respiratory viruses detected in Japanese children with acute wheezing illness.; BMC Infect Dis. , 11 , 168- (2011)
• 原著論文14: Nakamura M, Taira K, Tsukagoshi H,et al.; Detection of various respiratory viruses in patients with influenza-like illness before and after emergence of the 2009 pandemic H1N1 influenza virus in Okinawa.; Jpn J Infect Dis. , 64 (1) , 87-89 (2011)
• 原著論文15: Omura T, Iizuka S, Tabara K, et al.; Detection of human metapneumovirus genomes during an outbreak of bronchitis and pneumonia in a geriatric care home in Shimane, Japan, in autumn 2009.; Jpn J Infect Dis. , 64 (1) , 85-87 (2011)
• 原著論文16: Ishioka T, Kimura H, Kita H,et al.; Effects of respiratory syncytial virus infection and major basic protein derived from eosinophils in pulmonary alveolar epithelial cells (A549).; Cell Biol Int. , 35 (5) , 467-474 (2011)
• 原著論文17: Yoshizumi M, Kimura H, Okayama Y,et al.; Relationships between Cytokine Profiles and Signaling Pathways (IκB Kinase and p38 MAPK) in Parainfluenza Virus-Infected Lung Fibroblasts.; Front Microbiol. , 1 (124) (2010)
• 原著論文18: Mizuta K, Abiko C, Aoki Y,et al.; Endemicity of human metapneumovirus subgenogroups A2 and B2 in Yamagata,Japan between 2004 and 2009.; Microbiol Immunol. , 54 (10) , 634-638 (2010)
• 原著論文19: Itagaki T, Abiko C, Ikeda T,et al.; Sequence and phylogenetic analyses of Saffold cardiovirus from children with exudative tonsillitis in Yamagata, Japan; Scandinavian Journal of Infectious Dis. , 42 , 950-952 (2010)
• 原著論文20: Mizuta K, Hirata A, Suto A,et al.; Phylogenetic and cluster analysis of human rhinovirus species A (HRV-A) isolated from children with acute respiratory infections in Yamagata, Japan.; Virus Res. , 147 (2) , 265-274 (2010)

公開日・更新日

• 公開日: 2014-05-28
• 更新日: 2017-06-05

収支報告書

• 文献番号: 201225011Z