文献情報
文献番号
201224107A
報告書区分
総括
研究課題名
中枢神経症状を伴う筋疾患α-ジストログリカノパチーの分子病態と治療法開発に関する研究
課題番号
H22-神経・筋-若手-021
研究年度
平成24(2012)年度
研究代表者(所属機関)
萬谷 博(地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所))
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 障害者対策総合研究
研究開始年度
平成22(2010)年度
研究終了予定年度
平成24(2012)年度
研究費
3,826,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書(概要版)
研究目的
福山型先天性筋ジストロフィー症(FCMD)、Muscle-eye-brain病(MEB)、Walker-Warburg症候群(WWS)は中枢神経系の障害を伴う先天性筋ジストロフィー症である。これらの疾患はジストロフィン糖蛋白質複合体の構成分子であるα-ジストログリカンのO-マンノース型糖鎖不全を起因とし、α-ジストログリカノパチーと総称される。本研究では、α-ジストログリカノパチーの原因遺伝子産物及びO-マンノース型糖鎖の機能を解明することで、病態解明から診断・治療法への応用を目指している。
我々はこれまでに、MEBとWWSの原因遺伝子産物Protein O-linked mannose β1,2-N-acetyl glucosaminyltransferase 1(POMGnT1)とprotein O-mannosyltransferase 1(POMT1)及びPOMT2がO-マンノース型糖鎖の生合成に関わる糖転移酵素であることを明らかにしている。
O-マンノース型糖鎖の合成開始酵素であるO-マンノース転移酵素は2つのサブユニットPOMT1とPOMT2の複合体として小胞体(ER)膜に局在し、ドリコールリン酸マンノース(Dol-P-Man)を糖供与体としてタンパク質のSer/Thrにマンノースを転移する。ER膜にはDol-P-Manを供給するDol-P-Man合成酵素(DPM)も局在しており、DPMは3つのサブユニットDPM1、DPM2、DPM3からなる複合体である。
最近、α-ジストログリカノパチー様の症状を呈するDPM3遺伝子の変異が報告され、O-マンノース型糖鎖の合成が選択的に抑制されていることが示された。Dol-P-ManはO-マンノース型以外にも、N型糖鎖、C-マンノース型糖鎖、GPI-アンカー型糖鎖の合成に利用されることから、一般的にDPMの異常は広範囲な糖鎖異常として現れると予測される。実際、DPM1を原因遺伝子とする先天性グリコシル化異常症Ie型(CDG-Ie)では、Dol-P-Manを利用する全ての糖鎖で異常が検出される。DPM3遺伝子変異による疾患はCDG-Ioに分類され、比較的軽度なα-ジストログリカノパチーに相当し、筋ジストロフィー症状を呈するが、脳の障害はほとんど認められないという臨床症状が報告されている。生化学的にはα-ジストログリカンのO-マンノース型糖鎖不全として検出され、他のタイプの糖鎖への影響は少ない。このことから、DPM3がO-マンノース型糖鎖の生合成に選択的に関与している可能性が考えられる。そこで本年度は、POMT1およびPOMT2とDPM3の複合体形成について検討した。
我々はこれまでに、MEBとWWSの原因遺伝子産物Protein O-linked mannose β1,2-N-acetyl glucosaminyltransferase 1(POMGnT1)とprotein O-mannosyltransferase 1(POMT1)及びPOMT2がO-マンノース型糖鎖の生合成に関わる糖転移酵素であることを明らかにしている。
O-マンノース型糖鎖の合成開始酵素であるO-マンノース転移酵素は2つのサブユニットPOMT1とPOMT2の複合体として小胞体(ER)膜に局在し、ドリコールリン酸マンノース(Dol-P-Man)を糖供与体としてタンパク質のSer/Thrにマンノースを転移する。ER膜にはDol-P-Manを供給するDol-P-Man合成酵素(DPM)も局在しており、DPMは3つのサブユニットDPM1、DPM2、DPM3からなる複合体である。
最近、α-ジストログリカノパチー様の症状を呈するDPM3遺伝子の変異が報告され、O-マンノース型糖鎖の合成が選択的に抑制されていることが示された。Dol-P-ManはO-マンノース型以外にも、N型糖鎖、C-マンノース型糖鎖、GPI-アンカー型糖鎖の合成に利用されることから、一般的にDPMの異常は広範囲な糖鎖異常として現れると予測される。実際、DPM1を原因遺伝子とする先天性グリコシル化異常症Ie型(CDG-Ie)では、Dol-P-Manを利用する全ての糖鎖で異常が検出される。DPM3遺伝子変異による疾患はCDG-Ioに分類され、比較的軽度なα-ジストログリカノパチーに相当し、筋ジストロフィー症状を呈するが、脳の障害はほとんど認められないという臨床症状が報告されている。生化学的にはα-ジストログリカンのO-マンノース型糖鎖不全として検出され、他のタイプの糖鎖への影響は少ない。このことから、DPM3がO-マンノース型糖鎖の生合成に選択的に関与している可能性が考えられる。そこで本年度は、POMT1およびPOMT2とDPM3の複合体形成について検討した。
研究方法
HEK293T細胞にPOMT1およびPOMT2とDPM3を共発現し、免疫沈降法により複合体の形成の有無を調べた。POMT1とDPM3にはそれぞれMycタグとHSVタグの融合タンパク質を使用し、免疫沈降には抗mycタグ抗体および抗HSVタグ抗体を使用した。また、CDG-Ioで検出された変異(L85S)を導入した変異型DPM3をsite-direct mutagenesis法により作製し、変異の影響を調べた。共発現した細胞の膜画分タンパク質を用いて、DPM3および変異型DPM3との共発現によるPOMT活性への影響を確認した。
結果と考察
抗myc抗体および抗HSV抗体を用いた免疫沈降法によりPOMT1-POMT2とDPM3は複合体を形成することが明らかとなった。変異型DPM3もPOMT1-POMT2と共沈したことから、L85S変異は複合体形成に影響しないことが分かった。また、POMT1-POMT2にDPM3および変異型DPM3を共発現した場合とPOMT1-POMT2のみを発現させた場合でPOMT活性に有為な差は認められなかったことから、DPM3のPOMT1-POMT2への結合は直接POMT活性に影響しないことが示唆された。DPM3に変異がある細胞では、O-マンノース型糖鎖合成が選択的に抑制されることが報告されていることから、POMT1-POMT2はDPMと複合体を形成することによって、DPMにより合成されたDol-P-Manを効率良く利用するシステムが存在する可能性が考えられた。α-ジストログリカノパチーはO-マンノース型糖鎖の構造異常を起因とするが、糖転移酵素だけではなく糖供与などの制御異常に因り糖鎖異常が生じる複雑な疾患群であることを示唆している。今後、こうした複数の膜タンパク質からなる複合体の存在を証明し、機能や構造を解析する必要がある。
結論
POMT1-POMT2はDPM3を介してDPMと複合体を形成することが明らかとなった。
公開日・更新日
公開日
2015-05-20
更新日
-