細胞内膜構造に注目した運動神経病の画期的な治療法の開発

文献情報

• 文献番号: 201224102A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 細胞内膜構造に注目した運動神経病の画期的な治療法の開発
• 課題番号: H22-神経・筋-一般-014
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 小野寺 理(新潟大学 脳研究所生命科学リソース研究センター)

研究分担者(所属機関)

• 横関　明男(新潟大学　医学部　神経内科学　)
• 高橋　均(新潟大学　脳研究所　神経病理学)
• 山中　邦俊(熊本大学　発生医学研究所　遺伝学)
• 佐藤　俊哉(新潟大学　脳研究所　実験動物学)
• 牛木　辰男(新潟大学　医歯学系　解剖学)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 障害者対策総合研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 15,530,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

近年，運動神経疾患と細胞内膜構造（ゴルジ装置，小胞体）との関連が注目されている．遺伝性痙性対麻痺の原因蛋白であるatlastinは，その変異により細胞内の膜構造，特に，ゴルジ装置，小胞体の3次元構造の異常を引き起こす．さらに運動神経優位の軸索型の末梢神経障害を示すCMT病IIA型では，原因遺伝子であるmitofusion2の異常により，小胞体-ミトコンドリア間の結合が損なわれ，神経変性に至る．ALSでは，以前よりゴルジ装置の断片化が指摘され，これはTDP-43の封入体を伴う細胞に認められる．これらの事実は，運動神経細胞死に，細胞内小器官の異常が関わっていることを示唆している．しかし，その機序，病態については明らかではない．
我々はALS では核のTDP-43が消失していることから，本症にTDP-43の機能喪失が関与していると考え解析を進めてきた．現在までにTDP-43のノックアウトマウスは胎生致死であり，コンディショナルノックアウトマウスは早期に死亡することを明らかにしている．さらに，驚くべき事に TDP-43の喪失により，ゴルジ装置，小胞体の膜構造が破壊されることを見いだした．本研究計画ではTDP-43機能とゴルジ装置-小胞体システムとの関連を検討し，さらに運動神経細胞死における細胞内小器官の寄与について検討を加え，その細胞死のメカニズムを明らかにし，共通する治療方法を探求する．

研究方法

本研究計画では．TDP-43 の機能喪失モデル，ALS 関連ミスセンス変異型 TDP-43 導入モデル，を用い，細胞内の小器官の膜構造について検討する．対象とする細胞は，培養神経および胚性幹細胞より作製したヒト運動神経細胞，モデルマウス，モデル線虫，剖検ヒト組織にて解析する．コンディショナル ターゲッティングが可能な TDP-43 floxed マウス TDP-43(ex3)-flox，および，疾患関連変異型TDP-43 ノックインマウス TDP43(Q343R) を用い，免疫沈降法，免疫組織化学法にて検討する．さらに，そのゴルジ装置-小胞体構造について検討を加える．患者剖検組織にて，小胞体-ゴルジ装置を免疫組織化学，および，電子顕微鏡にて解析する．線虫にて確立したモデル系にて，想定される薬剤効果を確認する．また，線虫は容易に遺伝子のノックダウンを導入することができるため，これを用いて症状の重症度を規定する遺伝子ネットワークを明確にする.モデルマウスおよび線虫モデルを用い，膜構造を安定化させる薬剤の開発を試みる.

結果と考察

TDP-43欠損による細胞内膜構造の変化を検討するため， 3系統のcKOマウスを作成した．神経特異的KOマウスはTDP-43の免疫染色では，大脳皮質神経細胞で広範にTDP-43が消失し，前角運動神経においても，半数以上がTDP-43を消失していた．神経特異的KOマウスの頸部前角運動神経細胞の数には変化がなかったが，運動神経は萎縮性であった．またゴルジ体容積の明らかな減少を認めた．さらにチトクロームCの免疫染色では，ミトコンドリア形態の異常も疑われた．
そこで，これらの超微構造を検討するために，走査型電子顕微鏡を用い，本マウスの脊髄前角の運動神経のミトコンドリアを観察した．その結果，ミトコンドリアの膨化，クリステの増加など，明らかな構造の異常を認めた．一方ゴルジ装置の網状構造に大きな変化をみとめることはなかった．脊髄でのATP産生量は76.7%に低下していたが，定量的PCRによるミトコンドリアDNA量には変化を認めなかった．この事からミトコンドリアの機能異常を推察した．
この現象がTDP-43依存性であることを培養細胞系にて検討を加えた． TDP-43の非翻訳領域をターゲットとしたsiRNAにてTDP-43の発現を抑制した．その結果，これらの細胞では，ミトコンドリアは細切れかつ不整に染色され，ミトコンドリアの形態異常を認めた.本細胞系でミトコンドリアの形態維持に関連する蛋白質の挙動を検討した所，ミトコンドリア分裂に関わるDLP1のリン酸化がTDP-43の発現抑制により促進していることが確認された.

結論

神経特異的KOマウスの頸部前角運動神経細胞のゴルジ体の容積の減少．さらにミトコンドリア形態の異常も疑われた．走査型電子顕微鏡でも，ミトコンドリアの膨化，クリステの増加など，明らかな構造の異常を認めた．この現象がTDP-43依存性であることを培養細胞系にて検討を加え，ミトコンドリア分裂に関わるDLP1の関与が見いだされた. 今後，この遺伝子とTDP-43との関連を明らかにすることにより新たな治療方法が模索しうる．

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201224102B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 細胞内膜構造に注目した運動神経病の画期的な治療法の開発
• 課題番号: H22-神経・筋-一般-014
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 小野寺 理(新潟大学 脳研究所生命科学リソース研究センター)

研究分担者(所属機関)

• 横関　明男(新潟大学　医学部　神経内科学)
• 高橋　均(新潟大学　脳研究所　神経病理学)
• 山中　邦俊(熊本大学　発生医学研究所　遺伝学)
• 佐藤　俊哉(新潟大学　脳研究所　実験動物学)
• 牛木　辰男(新潟大学　医歯学系　解剖学)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 障害者対策総合研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

運動神経の変性を主体とする運動神経疾患は，その治療法の開発が最も望まれている．運動神経疾患には，筋萎縮性側索硬化症（ALS），痙性対麻痺，Charcot-Marie-Tooth病（CMT病）などの疾患が知られている．近年，それらの原因遺伝子の多くが単離され，各々の疾患毎に治療方法が検討されている．しかし，いまだ成功していない．一方，分子生物学的解析の発展により，ポリグルタミン病など，臨床像が相違しても，分子病態が類似している疾患群が明らかとなってきている．この事実は，従来の疾患概念を超え，分子病態に基づく病態の理解と治療方法の開発が可能となってきていることを示唆する．
この共通する分子病態という面から，運動神経疾患と細胞内膜構造との関連が注目されている．遺伝性痙性対麻痺の原因蛋白であるatlastinは，その変異により細胞内の膜構造，特に，ゴルジ装置，小胞体の3次元構造の異常を引き起こす．さらに運動神経優位の軸索型の末梢神経障害を示すCMT病IIA型では，原因遺伝子であるmitofusion2の異常により，小胞体-ミトコンドリア間の結合が損なわれ，神経変性に至る．ALSでは，以前より細胞内小器官の異常が指摘されている．しかし，その機序，病態については明らかではない．

研究方法

我々は本症にTDP-43の機能喪失が関与していると考え解析を進めてきた．驚くべき事に TDP-43の喪失により，ゴルジ装置，小胞体の膜構造が破壊されることを見いだした．本研究計画ではTDP-43機能と細胞内小器官との関連を検討し，その細胞死への寄与について検討を加え，共通する治療方法を探求する．
この目的のために，研究期間内に次の3点を解析することを目標とした①ALSのモデルマウスをTDP-43機能喪失仮説に基づきTDP-43コンディショナルノックアウト（cKO）マウスを作成する．②同マウス，患者脊髄前角細胞及び培養細胞系で細胞内膜系の微細構造の変化を走査電子顕微鏡にて解析する．この手法を開発し，それによる解析を行う．③より簡便なモデルとして線虫TDP-43ホモログ欠損変異体を用いて，TDP-43消失が線虫の発生・分化・運動・老化・寿命などにおよぼす影響を明らかにする　

結果と考察

TDP-43機能損失モデルを作成するために，3系統のcKOマウスを作成した．前角運動神経では半数以上がTDP-43を消失していた．神経特異的KOマウスの頸部前角運動神経細胞の数には変化がなかったが，運動神経は萎縮性であり，ゴルジ体容積の明らかな減少を認めた．さらにミトコンドリア形態の異常も疑われた．走査型電子顕微鏡を用い，本マウスの脊髄前角の運動神経のミトコンドリアを観察した．その結果，ミトコンドリアの膨化，クリステの増加など，明らかな構造の異常を認めた
一方，膜構造異常の原因として，細胞内膜の機能維持に重要な役割を持つVCPにも注目した．モデル動物として遺伝子改変が容易で生命周期の短い線虫を用い検討を加えた．野生型及び変異型VCPは生体内でTDP-43と安定な複合体を形成していないことが判明した．一方，線虫TDP-43欠損変異体は野生体と比べて，成長遅延，産卵数の減少，胚性致死率・雄出現率の上昇，ストレス感受性，運動能の低下，長寿命化などが観察された．
最後に，近年，ポリグルタミン病の一種であるspinocerebellar atrophy type2の原因蛋白であるataxin 2のポリグルタミン鎖軽度伸長が， ALSの危険因子になりうるということが報告された．我々はTDP－43の有無がポリグルタミンの凝集能に影響を及ぼすかどうかを調べた．ポリグルタミン凝集体形成線虫にTDP-43欠損を導入すると，凝集体形成能が有意に低下し，長寿命化が観察された．

結論

TDP-43欠損モデルに関しては，神経特異的KOマウスの表現型解析を中心に行い，ALSの病理学的変化である膜構造変化を捉えることに成功した．さらに，本研究では，前角ニューロンの細胞内膜系の立体微細構造を高分解能走査電顕で解析できる手法を確立し，TDP-43機能喪失による細胞内膜構造異常の実態を明らかにした．特にミトコンドリアの形態異常に繋げ，TDP-43の機能がミトコンドリアの形態ダイナミクスと関与していることを示した点は重要である．また今回の研究を通じて，種々の材料で，走査電顕による細胞内膜構造の観察を可能とする標本作製方法を開発した．同方法により他疾患においても，より詳細な細胞内構造の観察が可能となる．線虫モデルに関してはモデル線虫を作製し疾患型VCPとTDP-43との関連性の検討やloss-of-functionのモデルであるTDP-43欠損線虫の解析に関しては目的を達成できた．

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201224102C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究により，TDP-43機能喪失による細胞内膜の変化が，ミトコンドリアの形態異常にいたることを示唆し，そのターゲット分子としてDLP1の異常を同定し，ALS研究に新たな視点を与えた．この点で学術的な意義がある．また，今後の研究に必要な走査電顕による細胞内膜構造を観察しうる顕微鏡法を確立した点にも大きな意義がある．さらにTDP-43欠損により内因性の凝集体形成能が低下し長寿命化につながる観察結果は，凝集体形成機構の解明につながる．
• 臨床的観点からの成果: 本研究は臨床的観点からの直接的な波及効果は少ないが，本研究の理念は，難治性神経疾患のとらえ方と治療戦略を根本的に変えうるポテンシャルを持つ点が重要である．その意味で，膜構造異常をとらえ，その手がかりを見いだした点は特筆される．
• ガイドライン等の開発: 本研究はガイドラインの開発を目的としたものでは無い
• その他行政的観点からの成果: 本研究は，ALSの病態機序に基づいた画期的治療法開発への足掛かりになると考えられた． TDP-43欠損により内因性の凝集体形成能が低下し長寿命化につながる観察結果は，今後の凝集体病の治療戦略や治療薬の開発に貢献できる．これらの点から稀少難病の抜本的な解決を目指す足がかりを築いた点で行政的な意義がある
• その他のインパクト: 本研究機関にヒトでの観察を念頭に，これまでのオスミウム浸軟法では細胞内の可溶性タンパク質が除去できないことから，前角ニューロンの走査電顕観察ができなかったヒトの病理標本で，細胞内膜系の走査電顕観察が可能な手法を開発した．今後本方法を用いた患者前角細胞での細胞内膜構造の解析が可能となった．

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 7件
• その他論文(和文): 6件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 15件
• 学会発表(国際学会等): 2件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Y. Sasagawa, K. Yamanaka, Y. Saito-Sasagawa et al,; C. elegans UBX cofactors for CDC-48/p97 control spermatogenesis. ; Genes Cells , 15 , 1202-1215 (2010); 10.1111/j.1365-2443.2010.01454.x
• 原著論文2: K. Yamanaka, Y. Sasagawa, and T. Ogura; Recent advances in p97/VCP/Cdc48 cellular functions.; Biochem. Biophys. Acta , 1883 , 130-137 (2012); 10.1016/j.bbamcr.2011.07.001.
• 原著論文3: Koga D, Nakajima M, Ushiki T; A useful method for observing intracellular structures of free and cultures cells by scanning electron microscopy.; J Electron Microsc , 61 (2) , 105-111 (2012); 10.1093/jmicro/dfr098.
• 原著論文4: Toyoshima Y, Tanaka H, Shimohata M et al.; Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is associated with TDP-43 pathology.; Acta Neuropathol , 122 , 375-378 (2011); 10.1007/s00401-011-0862-7
• 原著論文5: Soma K, Fu Y-J, Wakabayashi K et al.; Co-occurrence of argyrophilic grain disease in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.; Neuropathol Appl Neurobiol , 38 , 54-60 (2012); 10.1111/j.1365-2990.2011.01175.x.
• 原著論文6: Shiga A, Ishihara T, Miyashita A et al.; Alteration of POLDIP3 splicing associated with loss of function of TDP-43 in tissues affected with ALS.; PLoS One. , 7 (8) , 43120-43120 (2012); 10.1371/journal.pone.0043120.
• 原著論文7: Konno T, Shiga A, Tsujino A et al.; Japanese amyotrophic lateral sclerosis patients with GGGGCC hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72.; J Neurol Neurosurg Psychiatry. , 84 (4) , 398-401 (2013); 10.1136/jnnp-2012-302272.
• 原著論文8: Akimoto C, Volk AE, van Blitterswijk M et al.; A blinded international study on the reliability of genetic testing for GGGGCC-repeat expansions in C9orf72 reveals marked differences in results among 14 laboratories.; J Med Genet. , 51 (6) , 419-424 (2014)
• 原著論文9: Takeuchi R, Tada M, Shiga A,et al.; Heterogeneity of cerebral TDP-43 pathology in sporadic amyotrophic lateral sclerosis: Evidence for clinico-pathologic subtypes.; Acta Neuropathol Commun. , 4 (1) , 61- (2016)
• 原著論文10: Koyama A, Sugai A, Kato T, et al.; Increased cytoplasmic TARDBP mRNA in affected spinal motor neurons in ALS caused by abnormal autoregulation of TDP-43.; Nucleic Acids Res. , 44 (12) , 5820-5836 (2016)
• 原著論文11: Hayashi K, Mochizuki Y, Takeuchi R, et al.; Clinicopathological characteristics of patients with amyotrophic lateral sclerosis resulting in a totally locked-in state (communication Stage V).; Acta Neuropathol Commun. , 4 (1) , 107- (2016)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-21
• 更新日: 2017-05-30

収支報告書

• 文献番号: 201224102Z