超細密染色体分析から捉え直すヒト発達障害研究

文献情報

• 文献番号: 201224100A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 超細密染色体分析から捉え直すヒト発達障害研究
• 課題番号: H22-神経・筋-一般-012
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 松本 直通(横浜市立大学 医学研究科環境分子医科学教室)

研究分担者(所属機関)

• 岡本伸彦(大阪府立母子保健総合医療センター　遺伝診療科)
• 橋本亮太(大阪大学大学院大阪大学・金沢大学・浜松医科大学・千葉大学・福井大学連合小児発達学研究科附属子どものこころの分子統御機構研究センター)
• 加藤光広(山形大学医学部発達生体防御学講座　小児医科学分野)
• 小坂仁(神奈川県立こども医療センター　神経内科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 障害者対策総合研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 28,263,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

Copy Number Variation (CNV)の発見によりヒト脳神経疾患ゲノム解析は新たな局面を迎えた。ほぼ同一のCNVが精神遅滞症候群やてんかんあるいは自閉症などの発達障害を含む多様なヒトの疾患を惹起していることが明らかになり、これら多様な疾患群の共通項がCNV（のみ）であるという新たな「genotype-first」の時代を迎えた。本研究は、先端技術を用いてこれらの発達期の様々な障害を対象に網羅的な解析を行いCNVの視点からこれらの疾患群を再定義し、CNVを利用した新たな効率的診断法と責任分子単離を行うことを目的とする。

研究方法

I.症例の集積
各研究分担者の協力を得、てんかん関連疾患・精神遅滞関連症候群ならび自閉症を広く集積する。
II.高密度アレーの比較検討
Affymetrix社Cytoscan HD（260万マーカーを搭載）、Agilent社とNimbleGen社の再高密度アレーを併用しCNV検出の感度や精度等を比較検討する。
III.疾患責任遺伝子の単離
CNV異常を認めないCoffin-Siris症候群典型例とSTXBP1・ARX異常を認めない大田原症候群典型例に対して次世代シーケンサーを用いた全エクソン領域の解析により新規責任遺伝子を特定する。さらに複数の微細欠失例の存在から責任遺伝子であることを強く疑われていたKDM6A遺伝子の変異解析をMLL2遺伝子変異陰性例のKabuki症候群に対して行う。

結果と考察

I.症例の集積
症例集積は順調に進行し既に自閉症は200例・精神遅滞関連症候群980例・てんかん関連症候群480例を超えた。Kabuki症候群も既に80例を超えて集積した。
II.高密度アレーの比較検討とCNV検出
Affymetrix社Cytoscan HDをprimary platformとして、他のプラットフォームの高密度アレーを併用した解析を進めcytoscan HDアレーの秀逸性を確認した。
III.疾患責任遺伝子の単離
Coffin-Siris症候群：Coffin-Siris症候群(以下CSSと称す)を対象に高密度マイクロアレーで解析を行ったが非典型例でのみ染色体微細欠失（6q25領域の9.2 Mb欠失）を認めるも、典型例10例でCNV異常はなかった。典型例5例を対象に全エクソーム解析を行い責任遺伝子SMARCB1異常を2例に同定した。これを契機にSWI/SNF複合体のサブユニットをコードする16遺伝子をスクリーニングし、SMARCA4異常を6例、SMARCE1異常を1例、ARID1A異常を3例、ARID1B異常を5例で認め、解析したCSS22症例中19症例でSWI/SNF複合体サブユニットの何れかの異常を認めた（Nat Genet 2012）。
大田原症候群：大田原症候群で既知責任遺伝子のARX及びSTXBP1異常の無いEIEE12例において全エクソーム解析を行い3例でKCNQ2のミスセンス変異を検出した。両親検索の結果de novoで生じた変化であった。このことはEIEEの原因としてKCNQ2が重要な位置を占めていることを強く示唆する（Ann Neurol 2012）。
Kabuki症候群:Kabuki症候群の原因を全エクソーム解析を用いてMLL2の単離した(ワシントン大学との共同研究、Nat Genet 2010）。2012年にMLL2陰性のKabuki症候群でKDM6Aを含むCNV異常（微細欠失）が他グループより報告され（Am J Hum Genet, 2012）、KDM6Aが第二の責任遺伝子として浮上した。我々は、MLL2異常を認めないKMS症例32例のKDM6A変異スクリーニングを施行し3例でKDM6A変異を認め、KDM6AがKabuki症候群の第二の責任遺伝子であることを証明した（Hum Mut 2013）。

結論

最終年度である平成24年度までに極めて質の高い発達障害関連疾患1500例超を集積した。高解像度のマイクロアレー解析において500例を超える症例の2次解析（アレー解析+他方での検証）を終了し、多数の疾患関連CNVを同定した。一方でCNV異常の無い症例について次世代シーケンサーを用いた全エクソーム解析法の開発を進め、高率に点変異を同定するシステムを確立した（平成22-23年度中期まで）。CNV解析とバックアップシステムとしての次世代解析を組み合わせて3疾患の遺伝子単離を行った。CNV解析と次世代解析は補完的で発達障害関連疾患の解析には両プラットフォームが必要である。本研究の当初の目標の多数の発達障害関連疾患を単離することが可能であった。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-04-10
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201224100B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 超細密染色体分析から捉え直すヒト発達障害研究
• 課題番号: H22-神経・筋-一般-012
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 松本 直通(横浜市立大学 医学研究科環境分子医科学教室)

研究分担者(所属機関)

• 岡本伸彦(大阪府立母子保健総合医療センター　遺伝診療科)
• 橋本亮太(大阪大学大学院大阪大学・金沢大学・浜松医科大学連合小児発達学研究科附属子どものこころの分子統御機構研究センター)
• 加藤光広(山形大学医学部発達生体防御学講座　小児医科学分野)
• 小坂仁(神奈川県立こども医療センター　神経内科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 障害者対策総合研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

Copy Number Variation (CNV)の発見によりヒト脳神経疾患ゲノム解析は新たな局面を迎えている。ほぼ同一のCNVが精神遅滞症候群やてんかんあるいは自閉症などの発達障害を含む多様なヒトの疾患を惹起していることが明らかになり、これら多様な疾患群の共通項がCNV（のみ）であるという新たな「genotype-first」の時代を迎えた。本研究は、先端技術を用いてこれらの発達期の様々な障害を対象に網羅的な解析を行いCNVの視点から責任分子単離を行うことを目的とした。

研究方法

I.症例の集積
各研究分担者の協力を得、てんかん関連疾患・精神遅滞関連症候群ならび自閉症を広く集積する。
II.高密度アレーの比較検討
Affymetrix社Cytoscan HD（260万マーカーを搭載）、Agilent社とNimbleGen社の再高密度アレーを併用しCNV検出の感度や精度等を比較検討する。
III. 疾患責任遺伝子の単離
CNV異常を認めなかった四肢異常を伴う小眼球症候群、びまん性大脳白質形成不全症、Coffin-Siris症候群とSTXBP1・ARX異常を認めない大田原症候群、あるいは原因が長らく不明であったKabuki症候群に対して、SNPアレータイピングを用いた小家系マッピングからのポジショナルクローニングや次世代シーケンサーを用いた全エクソン領域の解析により新規責任遺伝子を特定する。さらに2012年に明らかになった複数の微細欠失例の存在から責任遺伝子であることを強く疑われていたKDM6A遺伝子の変異解析をMLL2遺伝子変異陰性例のKabuki症候群に対して行う。

結果と考察

症例集積は順調に進行し自閉症は200例・精神遅滞関連症候群980例・てんかん関連症候群480例を集積し高解像度マイクロアレーを用いたCNV解析は500例超を完了、数多くの興味深いCNVの知見を得ることに成功した。これらの個々の症例の詳細な解析から疾患に関与する分子群の特定を進めた。研究期間3年間において複数の疾患の責任遺伝子の解明に成功した：四肢異常を伴う小眼球症候群の原因遺伝子SMOC1（Am J Hum Genet, 2011）・びまん性大脳白質形成不全症の２つの原因遺伝子POLR3AとPOLR3B (いずれもRNA polymerase IIIのサブユニットをコード)（Am J Hum Genet, 2011）・Coffin-Siris症候群の5つの原因遺伝子SMARCB1, SMARCA4, SMARCE1, ARID1A, ARID1B (いずれもSWI/SNF複合体のサブユニットの一つをコードする)（Nat Genet 2012）・大田原症候群のKCNQ2 （カリウムチャネルをコード）（Ann Neurol 2012）、Kabuki症候群のMLL2（Nat Genet 2010）、KDM6A（Hum Mut 2012）などの新規遺伝子同定を行った。最終年度である平成24年度までに極めて質の高い発達障害関連疾患1500例超を集積した。高解像度のマイクロアレー解析において500例を超える症例の2次解析（アレー解析+他方での検証）を終了し、多数の疾患関連CNVを同定した。一方でCNV異常の無い症例について次世代シーケンサーを用いた全エクソーム解析法の開発を進め、高率に点変異を同定するシステムを確立した（平成22-23年度中期まで）。CNV解析とバックアップシステムとしての次世代解析を組み合わせて5疾患の遺伝子単離を行った。MLAはSNPアレーを用いて小家系マッピングを行い遺伝子領域を特定、従来型のポジショナルクローニングから、CSSのSWI/SNFサブユニット遺伝子異常と大田原症候群のKCNQ2は、エクソーム解析の成果、Kabuki症候群のKDM6A異常は、染色体微細異常欠失からの遺伝子異常の同定である。

結論

CNV解析と次世代解析は補完的で発達障害関連疾患の解析には両プラットフォームが必要である。本研究の当初の目標であった、多数の発達障害関連疾患遺伝子の単離は、十分に達成されたと考える。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-04-15
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201224100C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 発達期の様々な障害を対象にCNVの視点から網羅的な解析を行い責任分子単離行うことを目的とした。高解像度マイクロアレーを用いてCNV解析は500例超を完了、数多くの興味深いCNVの知見を得た。これらの個々の症例の詳細な解析から疾患に関与する責任遺伝子の特定を進め複数の疾患の責任遺伝子の解明に成功した：四肢異常を伴う小眼球症候群・びまん性大脳白質形成不全症・Coffin-Siris症候群・大田原症候群、Kabuki症候群など。
• 臨床的観点からの成果: これまで原因が不明で臨床診断のみで行われていた発達障害関連疾患群において、複数の責任遺伝子を特定したことににより、確実な遺伝子診断が可能となった。さらに確定した責任遺伝子を包含するターゲットリシーケンスプラットフォームを開発することで、多数の遺伝子を搭載した効率的診断システムの開発が可能となり、遺伝子診断に効果を上げている。
• ガイドライン等の開発: 新規に責任遺伝子が特定された各種疾患について遺伝子解析を継続中であり、遺伝子レベルで確定した症例群の臨床情報を詳細に検討することで、分子診断に基づく疾患表現型が明らかになってきた。これらのデータを集積していくことで疾患の概要が明らかとなり診断基準等の策定が可能となる。
• その他行政的観点からの成果: 本研究期間の前半期に、マイクロアレーによるCNV同定が不可能だった症例を解決するための手法として次世代シーケンスを用いた全エクソーム解析研究を開始し疾病原因となる遺伝子異常同定の検出システムを確立することができた。これらの研究過程で得られた成果を得て次世代シーケンス研究拠点を形成した。
• その他のインパクト: 四肢異常を伴う小眼球症候群・びまん性大脳白質形成不全症・Coffin-Siris症候群などの疾患の原因特定に際して、プレスリリース活動、各種メディアに対して積極的な働きかけを行い新聞やWebニュース等で広く報道された。また遺伝子単離に至った一連の研究は、学会シンポジウム、各種研究会での招聘講演等で3年間で43回程度講演を行い広く成果を発表した。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 65件
• その他論文(和文): 13件
• その他論文(英文等): 1件
• 学会発表(国内学会): 33件
• 学会発表(国際学会等): 10件
• その他成果(特許の出願): 6件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 45件

特許

• 特許の名称: Waardenburg無眼球症候群の検出方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2010-106974 ; 発明者名: 松本直通 ; 権利者名: 横浜市立大学 ; 出願年月日: 20100507 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 常染色体劣性遺伝性脊髄小脳変性症の検出方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願 2011-136277 ; 発明者名: 松本直通・土井宏 ; 権利者名: 横浜市立大学 ; 出願年月日: 20110620 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: び慢性大脳白質形成不全症の検出方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2011-226488 ; 発明者名: 才津浩智・松本直通 ; 権利者名: 横浜市立大学 ; 出願年月日: 20111014 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 孔脳症および周産期脳出血の検出方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2011-247457 ; 発明者名: 才津浩智・松本直通 ; 権利者名: 横浜市立大学 ; 出願年月日: 20111111 ; 国内外の別: 国内・PCT

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Miyake N, Kosho T, Mizumoto S, et al.; Loss-of-function mutations of CHST14 in a new type of Ehlers-Danlos syndrome.; Hum Mut , 31 (8) , 966-974 (2010); 10.1002/humu.21300
• 原著論文2: Osaka H, Hamanoue H, Yamamoto R, et al.; Disrupted SOX10 regulation of GJC2 transcription causes Pelizaeus-Merzbacher-like disease.; Ann Neurol , 68 (2) , 250-254 (2010); 10.1002/ana.22022
• 原著論文3: Ng SB, Bigham AW, Buckingham KJ, et al.; Exome sequencing identifies MLL2 mutations as a cause of Kabuki syndrome.; Nat Genet , 42 (9) , 790-793 (2010); 10.1038/ng.646
• 原著論文4: Saitsu H, Kato M, Okada I, et al.; STXBP1 mutations in early infantile epileptic encephalopathy with suppression-burst pattern.; Epilepsia , 51 (12) , 2397-2405 (2010); 10.1111/j.1528-1167.2010.02728.x
• 原著論文5: Okada I, Hamanoue H, Terada K, et al.; SMOC1 is essential for ocular and limb development in humans and mice. SMOC1 is essential for ocular and limb development in humans and mice.; Am J Hum Genet , 88 (1) , 30-41 (2011); 10.1016/j.ajhg.2010.11.012
• 原著論文6: Tsurusaki Y, Osaka H, Hamanoue H, et al.; Rapid detection of a mutation causing X-linked leucoencephalopathy by exome sequencing.; J Med Genet , 48 (9) , 606-609 (2011); 10.1136/jmg.2010.083535
• 原著論文7: Saitsu H, Matsumoto N, et al.; De novo mutations in epilepsy.; Dev Med Child Neurol , 53 (9) , 806-807 (2011); 10.1111/j.1469-8749.2011.03994.x
• 原著論文8: Tsurusaki Y, Okamoto N, Suzuki Y, et al.; Exome sequencing of two patients in a family with atypical X-linked leukodystrophy.; Clin Genet , 80 (2) , 161-166 (2011); 10.1111/j.1399-0004.2011.01721.x
• 原著論文9: Doi H, Yoshida K, Yasuda T, et al.; Exome sequencing reveals a homozygous SYT14 mutation in adult-onset, autosomal-recessive spinocerebellar ataxia with psychomotor retardation.; Am J Hum Genet , 89 (2) , 320-327 (2011); 10.1016/j.ajhg.2011.07.012
• 原著論文10: Saitsu H, Osaka H, Sasaki M, et al.; Mutations in POLR3A and POLR3B encoding RNA Polymerase III subunits cause an autosomal-recessive hypomyelinating leukoencephalopathy.; Am J Hum Genet , 89 (5) , 644-651 (2011); 10.1016/j.ajhg.2011.10.003
• 原著論文11: Yoneda Y, Haginoya K, Arai H, et al.; De novo and inherited mutations in COL4A2, encoding the type IV collagen α2 chain cause porencephaly.; Am J Hum Genet , 90 (1) , 86-90 (2012); 10.1016/j.ajhg.2011
• 原著論文12: Hamdan FF, Saitsu H, Nishiyama K, et al.; Identification of a novel in-frame de novo mutation in SPTAN1 in intellectual disability and pontocerebellar atrophy.; Eur J Hum Genet , 20 (7) , 796-800 (2012); 10.1038/ejhg.2011.271
• 原著論文13: Tsurusaki Y, Okamoto N, Ohashi H, et al.; Mutations affecting components of the SWI/SNF complex cause Coffin-Siris syndrome.; Nat Genet , 44 (4) , 376-378 (2012); 10.1038/ng.2219
• 原著論文14: Writzl K, Primec ZR, Stražišar BG, et al.; Early onset West syndrome with severe hypomyelination and coloboma-like optic discs in a girl with SPTAN1 mutation.; Epilepsia , 53 (6) , 106-110 (2012); 1111/j.1528-1167.2012.03437.x
• 原著論文15: Osaka H, Takagi A, Tsuyusaki Y, et al.; Contiguous deletion of SLC6A8 and BAP31 in a patient with severe dystonia and sensorineural deafness.; Mol Genet Metab , 106 (1) , 43-47 (2012); 10.1016/j.ymgme.2012.02.018
• 原著論文16: Saitsu H, Kato M, Osaka H, et al.; CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia.; Epilepsia , 53 (8) , 1441-1449 (2012); 10.1111/j.1528-1167.2012.03548.x
• 原著論文17: Tsurusaki Y, Saitoh S, Tomizawa K, et al.; A DYNC1H1 mutation causes a dominant spinal muscular atrophy with lower extremity predominance.; Neurogenetics , 13 (4) , 327-332 (2012); 10.1007/s10048-012-0337-6
• 原著論文18: Saitsu H, Kato M, Koide A, et al.; Whole exome sequencing identifies KCNQ2 mutations in Ohtahara syndrome.; Ann Neuro , 72 (2) , 298-300 (2012); 10.1002/ana.23620
• 原著論文19: Miyake N, Mizuno S, Okamoto N, et al.; KDM6A point mutations cause Kabuki syndrome.; Hum Mutat , 34 (1) , 108-110 (2013); 10.1002/humu.22229
• 原著論文20: Yoneda Y, Haginoya K, Kato M, et al.; Phenotypic spectrum of COL4A1 mutations: porencephaly to schizencephaly.; Ann Neurol , 73 (1) , 48-57 (2013); 10.1002/ana.23736

公開日・更新日

• 公開日: 2013-04-15
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201224100Z