文献情報
文献番号
199800075A
報告書区分
総括
研究課題名
経表皮的ワクチン法の開発に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
瀧川 雅浩(浜松医科大学)
研究分担者(所属機関)
- 瀬尾尚宏(浜松医科大学)
研究区分
厚生科学研究費補助金 行政政策研究分野 厚生科学特別研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
3,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
ランゲルハンス細胞(LC)を含む樹状細胞は、近年になりその細胞上の主要組織適合クラスI分子を介してウイルス抗原や癌抗原などの内在性の抗原を効率的に細胞障害性T細胞(CTL)提示することが判明し、この細胞を用いた抗ウイルスワクチン法または癌治療法の研究が大きく注目されている。皮膚の表皮には多数のLCが常在しているので、皮膚へのウイルスペプチドまたは癌ペプチド、さらには抗原含有遺伝子の塗布により効果的なワクチン法が開発できるに違いない。しかしながら正常皮膚でLCは休止状態にありThやCTLへの抗原提示能は低く、リンパ節内への移動性にも富まないので正常皮膚を用いてはウイルスワクチン法や癌治療法は実現不可能であろう。
我々はこれまでに皮膚最外層の角質層バリアをテープストリッピング(TS)によって破壊すると、その皮膚でLCが活性化し、リンパ節内へ移動し効率的にTh細胞に抗原提示することを証明した。そこで本研究においてはバリア破壊皮膚へのウイルスペプチド、癌ペプチドさらには抗原DNAの適用においてウイルスワクチンまたは癌治療が可能であるかを詳細に検討した。
我々はこれまでに皮膚最外層の角質層バリアをテープストリッピング(TS)によって破壊すると、その皮膚でLCが活性化し、リンパ節内へ移動し効率的にTh細胞に抗原提示することを証明した。そこで本研究においてはバリア破壊皮膚へのウイルスペプチド、癌ペプチドさらには抗原DNAの適用においてウイルスワクチンまたは癌治療が可能であるかを詳細に検討した。
研究方法
ペプチド MHCクラスIH-2Kb分子により提示されCTLの誘導可能なHSVgpBペプチド、VSV NPペプチド、TRP-2ペプチド(B16メラノーマのエピトープ)、MUT1ペプチド(3LL肺癌のエピトープ)、OVAペプチドを用いた。また抗原DNAとしてGTS社のpGenegripを用いた。
バリア破壊 C57BL/6(B6)マウス耳翼または毛を剃った腹部皮膚をセロファンテープを用いそれぞれ8回または15回TS角質層を破壊した。
ペプチド塗布 TSにより皮膚バリアを破壊し、12、24、48時間後に種々の濃度でアセトン:オリーブオイル、4:1に溶解させたペプチドを塗布した。
CTLの調整 B6マウス耳翼にペプチドを塗布し、一週間後の頚部リンパ節からリンパ球を調整し、これを2 U/mlのrIL-2を含むRPMI-1640培地で3日間培養し、感作されたリンパ球だけを増殖させた。また別にB6マウス耳翼にペプチドを塗布し、2週間後に腹部に同じペプチドを塗布した。2回目のペプチド塗布後5日目のヒ臓からヒ細胞を調整した。これをナイロンウールカラムを用いてヒ細胞のT細胞分画を得た。これを2 U/mlのrIL-2を含むRPMI-1640培地で3日間培養し、ペプチドにより感作されたリンパ球だけを増殖させた。
LCによるCTL感作能を調べるために、B6マウス耳翼から表皮シートを得て、これを0.2%トリプシン処理することにより表皮細胞浮遊液を得た。この浮遊液を遠心分離にかけ、LCを含む単核球を分離した。これを抗マウスI-Ab抗体で処理し、抗体処理単核球を得た。I-Ab抗原陽性細胞は抗マウスIgG抗体の結合した磁気ビーズを用いて単離した。I-Ab陽性表皮細胞のペプチドパルスは、50μg/mlのペプチドを含む培地でインキュベーションすることにより行い。1回洗浄後、正常B6マウス頚部リンパ球と混合培養することによりペプチド特異的リンパ球を感作した。感作されたリンパ球がペプチド特異的CTLかどうか以下のCTLアッセイにより検討した。
CTLアッセイ 生体内においてH-2Kbに拘束したペプチド特異的CTLの誘導を見るためにLtk-細胞にH-2Kb遺伝子を導入したLkb細胞を作製し、これをCr51ラベルし、ペプチドパルスしたものを標的細胞として用いた。さらに50μg/mlのペプチドを含むRPMI-1640培地で1時間インキュベーションした。これをCTLアッセイの標的細胞としてもちいた。CTLアッセイ96穴プレートに1x104個の標的細胞を入れ、これに上記CTLを種々の比で加え行った。8時間後遠心し、上清と下層に分けそれぞれの中に含まれる51Cr量をγ-カウンターでカウントした。
ペプチド特異的CTL前駆細胞の定量 頚部リンパ節内におけるペプチド特異的CTL前駆細胞頻度は、限界希釈法により定量した。
バリア破壊 C57BL/6(B6)マウス耳翼または毛を剃った腹部皮膚をセロファンテープを用いそれぞれ8回または15回TS角質層を破壊した。
ペプチド塗布 TSにより皮膚バリアを破壊し、12、24、48時間後に種々の濃度でアセトン:オリーブオイル、4:1に溶解させたペプチドを塗布した。
CTLの調整 B6マウス耳翼にペプチドを塗布し、一週間後の頚部リンパ節からリンパ球を調整し、これを2 U/mlのrIL-2を含むRPMI-1640培地で3日間培養し、感作されたリンパ球だけを増殖させた。また別にB6マウス耳翼にペプチドを塗布し、2週間後に腹部に同じペプチドを塗布した。2回目のペプチド塗布後5日目のヒ臓からヒ細胞を調整した。これをナイロンウールカラムを用いてヒ細胞のT細胞分画を得た。これを2 U/mlのrIL-2を含むRPMI-1640培地で3日間培養し、ペプチドにより感作されたリンパ球だけを増殖させた。
LCによるCTL感作能を調べるために、B6マウス耳翼から表皮シートを得て、これを0.2%トリプシン処理することにより表皮細胞浮遊液を得た。この浮遊液を遠心分離にかけ、LCを含む単核球を分離した。これを抗マウスI-Ab抗体で処理し、抗体処理単核球を得た。I-Ab抗原陽性細胞は抗マウスIgG抗体の結合した磁気ビーズを用いて単離した。I-Ab陽性表皮細胞のペプチドパルスは、50μg/mlのペプチドを含む培地でインキュベーションすることにより行い。1回洗浄後、正常B6マウス頚部リンパ球と混合培養することによりペプチド特異的リンパ球を感作した。感作されたリンパ球がペプチド特異的CTLかどうか以下のCTLアッセイにより検討した。
CTLアッセイ 生体内においてH-2Kbに拘束したペプチド特異的CTLの誘導を見るためにLtk-細胞にH-2Kb遺伝子を導入したLkb細胞を作製し、これをCr51ラベルし、ペプチドパルスしたものを標的細胞として用いた。さらに50μg/mlのペプチドを含むRPMI-1640培地で1時間インキュベーションした。これをCTLアッセイの標的細胞としてもちいた。CTLアッセイ96穴プレートに1x104個の標的細胞を入れ、これに上記CTLを種々の比で加え行った。8時間後遠心し、上清と下層に分けそれぞれの中に含まれる51Cr量をγ-カウンターでカウントした。
ペプチド特異的CTL前駆細胞の定量 頚部リンパ節内におけるペプチド特異的CTL前駆細胞頻度は、限界希釈法により定量した。
結果と考察
バリア破壊皮膚への抗原ペプチド塗布による特異的CTLの感作
HSVgpB, VSV NP, TRP-2, MUT1,OVAペプチド,さらにはpGeneGripをB6マウス耳翼の角質層を破壊後、経時的に塗布した時,用いた全てのペプチドにおいて、頚部リンパ節内でそのペプチド特異的なCTLがH-2Kb拘束的に感作されることが判った。また感作される強さはTS後12~24時間でペプチドを塗布した時であることが判った。一方DNA塗布の場合バリア破壊後すぐに塗布することで、ランゲルハンス細胞が効果的に取り込むことが判った。
次に一回目はTS後耳翼を用い、二回目は2週間後にTS腹部皮膚を用いてペプチドを塗布すると全身でペプチド特異的CTLが感作されるかどうかについて検討してみた。HSVgpBまたはTRP-2ペプチドいずれを用いた場合も、2回抗原塗布後、ヒ臓内でペプチド特異的CTLが感作されることが判った。この結果は、バリア破壊皮膚を用いて抗原ペプチド塗布を数回行えば、全身で特異的CTLを感作さらには増幅させることが可能であることを示していた。
バリア破壊皮膚への癌抗原ペプチド塗布による癌ワクチン及び癌の免疫治療実験
上述のようにTSしたB6マウス耳翼及び腹部皮膚を用いてTRP-2またはMUT1ペプチド免疫を2回行なった後に、それぞれにB16細胞または3LL細胞を皮下移植時の癌細胞の増殖について検討した。結果、TRP-2免疫されたマウスは、B16細胞の移植を拒絶し、3ヵ月以上生存した。一方MUT1免疫されたマウスは移植3LL細胞の増殖を極度に低下させるが、完全な拒絶には至らず1ヵ月後には全てのマウスが死亡した。
次にB16担癌マウスにTS耳翼及び腹部にTRP-2塗布を行なった結果、B16細胞の増殖抑制または退縮がすべてのマウスに見られた。一方、3LL担癌マウスに同様の方法でMUT1塗布した場合、顕著な3LLの増殖抑制が観察されるものの90%のマウスが死亡した。
リンパ節内におけるCTL前駆細胞頻度
頚部リンパ節におけるHSVgpB、TRP-2またはMUT1特異的CTL前駆細胞の頻度を限界希釈法により算出した結果、HSVgpB、TRP-2、MUT1特異的CTL前駆細胞頻度はそれぞれ1/4565、1/6055、1/28550であった。この結果はHSVgpBまたはTRP-2特異的CTL前駆細胞はもともと大きなクローンとして生体内に存在しており、MUT1特異的CTL前駆細胞はそれに比べるとかなり低い頻度で存在していることを示していた。
バリア破壊皮膚への抗原ペプチド塗布による生体内での特異的CTL感作における表皮LCの関与
次にTS耳翼または正常耳翼からLC-enriched fractionを得て、それにTRP-2パルスしたものと頚部リンパ球との混合培養による特異的CTLの感作実験を行なった。結果、TS耳翼から分離したLC分画は正常耳翼から分離したLC分画よりも強くCTLを感作した。一方、どちらの耳翼から得たLC除去分画もCTL感作能を全く持たなかった。
ヘルペスウイルスのように潜在的に感染しているウイルスについては、それに特異的なCTLの頻度が既に高いので、この方法は大変効果的なワクチン法となるに違いないが、癌治療においてはより特異的CTL頻度の高い癌抗原ペプチドの選択が治療効果を高める大きな要因となるであろう。以前の我々の研究でこの方法はTh細胞をも強く感作できることが証明されている。さらにCTL誘導にはTh1細胞の助けは重要なので、CTL特異的ペプチドと共にTh1細胞特異的ペプチドを併用して塗布すればより高いワクチン効果が得られるかもしれない。また一種類のペプチドよりもカクテルの方がより効果的であるといわれているので、種々のペプチドを混ぜた抗原液のバリア破壊皮膚への塗布はより高い特異的CTL感作が期待できるかもしれない。またペプチド単独のパルスよりもheat shock protein(HSP)を結合させたペプチドの方が樹状細胞はより効率的にCTLへ抗原提示することが判っているので、それらの応用も重要であろう。抗原遺伝子を組み込んだベクターのパルスが効果的なことは知られており、本研究でもその可能性が考えられたので、抗原DNA塗布は最良の方法になるかもしれない。
HSVgpB, VSV NP, TRP-2, MUT1,OVAペプチド,さらにはpGeneGripをB6マウス耳翼の角質層を破壊後、経時的に塗布した時,用いた全てのペプチドにおいて、頚部リンパ節内でそのペプチド特異的なCTLがH-2Kb拘束的に感作されることが判った。また感作される強さはTS後12~24時間でペプチドを塗布した時であることが判った。一方DNA塗布の場合バリア破壊後すぐに塗布することで、ランゲルハンス細胞が効果的に取り込むことが判った。
次に一回目はTS後耳翼を用い、二回目は2週間後にTS腹部皮膚を用いてペプチドを塗布すると全身でペプチド特異的CTLが感作されるかどうかについて検討してみた。HSVgpBまたはTRP-2ペプチドいずれを用いた場合も、2回抗原塗布後、ヒ臓内でペプチド特異的CTLが感作されることが判った。この結果は、バリア破壊皮膚を用いて抗原ペプチド塗布を数回行えば、全身で特異的CTLを感作さらには増幅させることが可能であることを示していた。
バリア破壊皮膚への癌抗原ペプチド塗布による癌ワクチン及び癌の免疫治療実験
上述のようにTSしたB6マウス耳翼及び腹部皮膚を用いてTRP-2またはMUT1ペプチド免疫を2回行なった後に、それぞれにB16細胞または3LL細胞を皮下移植時の癌細胞の増殖について検討した。結果、TRP-2免疫されたマウスは、B16細胞の移植を拒絶し、3ヵ月以上生存した。一方MUT1免疫されたマウスは移植3LL細胞の増殖を極度に低下させるが、完全な拒絶には至らず1ヵ月後には全てのマウスが死亡した。
次にB16担癌マウスにTS耳翼及び腹部にTRP-2塗布を行なった結果、B16細胞の増殖抑制または退縮がすべてのマウスに見られた。一方、3LL担癌マウスに同様の方法でMUT1塗布した場合、顕著な3LLの増殖抑制が観察されるものの90%のマウスが死亡した。
リンパ節内におけるCTL前駆細胞頻度
頚部リンパ節におけるHSVgpB、TRP-2またはMUT1特異的CTL前駆細胞の頻度を限界希釈法により算出した結果、HSVgpB、TRP-2、MUT1特異的CTL前駆細胞頻度はそれぞれ1/4565、1/6055、1/28550であった。この結果はHSVgpBまたはTRP-2特異的CTL前駆細胞はもともと大きなクローンとして生体内に存在しており、MUT1特異的CTL前駆細胞はそれに比べるとかなり低い頻度で存在していることを示していた。
バリア破壊皮膚への抗原ペプチド塗布による生体内での特異的CTL感作における表皮LCの関与
次にTS耳翼または正常耳翼からLC-enriched fractionを得て、それにTRP-2パルスしたものと頚部リンパ球との混合培養による特異的CTLの感作実験を行なった。結果、TS耳翼から分離したLC分画は正常耳翼から分離したLC分画よりも強くCTLを感作した。一方、どちらの耳翼から得たLC除去分画もCTL感作能を全く持たなかった。
ヘルペスウイルスのように潜在的に感染しているウイルスについては、それに特異的なCTLの頻度が既に高いので、この方法は大変効果的なワクチン法となるに違いないが、癌治療においてはより特異的CTL頻度の高い癌抗原ペプチドの選択が治療効果を高める大きな要因となるであろう。以前の我々の研究でこの方法はTh細胞をも強く感作できることが証明されている。さらにCTL誘導にはTh1細胞の助けは重要なので、CTL特異的ペプチドと共にTh1細胞特異的ペプチドを併用して塗布すればより高いワクチン効果が得られるかもしれない。また一種類のペプチドよりもカクテルの方がより効果的であるといわれているので、種々のペプチドを混ぜた抗原液のバリア破壊皮膚への塗布はより高い特異的CTL感作が期待できるかもしれない。またペプチド単独のパルスよりもheat shock protein(HSP)を結合させたペプチドの方が樹状細胞はより効率的にCTLへ抗原提示することが判っているので、それらの応用も重要であろう。抗原遺伝子を組み込んだベクターのパルスが効果的なことは知られており、本研究でもその可能性が考えられたので、抗原DNA塗布は最良の方法になるかもしれない。
結論
MHCクラスI拘束性のHSVgpB, VSVNP, TRP-2, MUT1, OVAペプチドさらにはDNA抗原を、TSにより角質層除去した皮膚へ塗布した場合、角質層除去後12-24時間(DNAの場合除去後すぐ)で塗布した時に最も強く近傍リンパ節内においてそれらペプチドに特異的なCTLが感作された。TSB6マウス耳翼と腹部によるペプチド塗布を行うと、全身でペプチド特異的CTL活性が高まった。この方法によりTRP-2またはMUT1免疫したマウスは、それぞれB16細胞または3LL細胞の皮下移植を拒絶した。さらにこの免疫法をB16または3LL担癌マウスに行った時、各々癌細胞増殖の極端な低下が観察された。以上より角質層破壊皮膚はウイルスワクチン法または癌治療法実施の場として有用であることが判った。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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