新しいアッセイ法による認知症治療薬の効果判定

文献情報

文献番号
201218007A
報告書区分
総括
研究課題名
新しいアッセイ法による認知症治療薬の効果判定
課題番号
H22-認知症-若手-008
研究年度
平成24(2012)年度
研究代表者(所属機関)
二井　勇人(東北大学　大学院農学研究科)
研究分担者(所属機関)
  • 石浦　章一(東京大学　大学院総合文化研究科)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 認知症対策総合研究
研究開始年度
平成22(2010)年度
研究終了予定年度
平成24(2012)年度
研究費
1,635,000円
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
アルツハイマー病の原因となる、アミロイドβ蛋白質（Aβ）の生成には、β、γセクレターゼの２つのプロテアーゼが関与する。私たちは、酵素機能が依然として不明なヒトγセクレターゼ複合体を酵母に再構成し、試験管内でγセクレターゼ活性を測定できる系を世界で初めて開発した。また、βセクレターゼ（BACE1）について、活性化機構の知見を積み重ねて阻害剤を開発してきた。本研究の目的は、β、γセクレターゼの酵素機能を解明し、私たちが明らかにした特徴から新たな治療法を提案することである。
私たちは、Aβを脳内から除去する方法として食物ワクチンの有効性についても、検討してきた。Aβを発現させたピーマン葉や米を経口投与すると、脳内のAβ蓄積を防ぐことができる。本研究では、ワクチンと阻害剤の併用によるアルツハイマー病治療の有効性も解析する。
研究方法
ヒトγセクレターゼを構成する4つの遺伝子（プレセニリン、ニカストリン、Aph-1、Pen2）とヒトアミロイド前駆体（APP）断片を酵母細胞内に導入した。これにより、①酵母の膜画分を調製し、試験管内でAβ生成活性を測定する。②酵母の生育を指標にγセクレターゼ活性を評価する。以上の２つの評価系を使って、平成２４年度には、①Aβの生成に影響を及ぼすγセクレターゼモジュレーターとして注目されている非ステロイド性抗炎症剤（NSAIDs）の作用機構を解析し、②天然物ライブラリーからγセクレターゼ阻害剤を探索・同定した。また、動物治療実験では、アルツハイマー病モデル（Tg2576）マウスにAβ発現米とNSAIDsを投与し（８～１１ヶ月齢）、その効果を、動物行動実験（Y迷路）により解析した。さらに、脳内での老人斑形成への効果について免疫組織染色により解析した。
結果と考察
①Aβ42の減少効果が期待されるγセクレターゼモジュレーター（NSAIDs）の作用機構を解析した。酵母Aβ生成系へのNSAIDs添加では、Aβ生成活性が著しく阻害された。また、APPを導入したチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞の培地にNSAIDsを投与する実験を行ったところ、NSAIDsはAβ分子種のうち、毒性の高いAβ42（数字はアミノ酸長）の生成量を大きく下げることが明らかとなった。APPもしくはC99断片からは、Aβ40が９割程度、Aβ42が１割程度生成する。様々なAPP断片を検討した結果、C末端を欠失する断片では、Aβ42のみが生成する一方で、NSAIDsが効かなくなることが明らかとなった。
　②平成２３年度から継続して、γセクレターゼ活性の制御を目標にした天然物ライブラリーのスクリーニングを行った。スクリーニング総数1400のうち、57個を酵母の生育で選別し、実際にAβ生成系で阻害効果が見られた薬剤を１つ獲得した。スクリーニングによる問題点は、抗菌作用によって酵母が生育できない薬剤が多く、それによって多くの擬陽性が得られた。
　③アルツハイマー病モデルマウス（Tg2576）の治療実験を行った。私たちが開発した食物ワクチン（Aβ米）とNSAIDsを併せて経口投与する効果を解析した。１１ヶ月齢時で、自発行動量・空間作業記憶の低下に対して、併用による改善効果が見られている。Aβ米投与群では老人斑が除去されたが、併用によりそれが促進するかについてはさらなる解析が必要である。

γセクレターゼモジュレーター（NSAIDs）が、Aβ活性、なかでもAβ40とAβ42の切り分けに影響を与えるということが示唆されてきた。私たちの酵母を用いた解析系でもこれが確認できたことは大きな成果である。また、APPのC末端領域にNSAIDsが作用する可能性が示唆された。この領域は細胞質に露出した種々の蛋白質が結合する重要な領域であり、今後、詳細な作用機構を明らかにしたい。γセクレターゼ阻害剤のスクリーニングでは、酵母の生育を指標にしてスクリーニングするため、生育に対して影響を与える薬剤が擬陽性として取得された。今後は、レポーター遺伝子として酵素活性で評価するβ-ガラクトシダーゼなどを用いてスクリーニングの精度を上げたい。動物の治療実験では、これまでに効果が見られていたAβ米に加えてNSAIDsを投与するとさらに改善することが、行動実験で確認された。ワクチン療法と薬剤の併用については今後さらに検討していきたい。
結論
酵母Aβ生成系を用いて、γセクレターゼモジュレータNSAIDsの効果を検証し、APPのカルボキシ末端領域がNSAIDsの作用に必要であることを明らかにした。また、モデルマウスの治療実験では、Aβ米を使った食物ワクチン療法とNSAIDsの併用の有効性を示した。いずれも経口投与が可能であり、比較的マイルドな療法の組み合わせによって最大限の効果を目指す方向性を提案したい。

公開日・更新日

公開日
2013-06-07
更新日
-

研究報告書（PDF）

文献情報

文献番号
201218007B
報告書区分
総合
研究課題名
新しいアッセイ法による認知症治療薬の効果判定
課題番号
H22-認知症-若手-008
研究年度
平成24(2012)年度
研究代表者(所属機関)
二井　勇人(東北大学　大学院農学研究科)
研究分担者(所属機関)
  • 石浦章一(東京大学　大学院総合文化研究科)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 認知症対策総合研究
研究開始年度
平成22(2010)年度
研究終了予定年度
平成24(2012)年度
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
アルツハイマー病の原因となる、アミロイドβ蛋白質（Aβ）の生成には、β、γセクレターゼの２つのプロテアーゼが関与する。私たちは、酵素機能が依然として不明なヒトγセクレターゼ複合体を酵母に再構成し、試験管内でγセクレターゼ活性を測定できる系を世界で初めて開発した。また、βセクレターゼ（BACE1）について、活性化機構の知見を積み重ねて阻害剤を開発してきた。本研究の目的は、β、γセクレターゼの酵素機能を解明し、私たちが明らかにした特徴から新たな治療法を提案することである。
私たちは、Aβを脳内から除去する方法として食物ワクチンの有効性についても、検討してきた。Aβを発現させたピーマン葉や米を経口投与すると、脳内のAβ蓄積を防ぐことができる。本研究では、ワクチンと阻害剤の併用によるアルツハイマー病治療の有効性も解析する。
研究方法
ヒトγセクレターゼを構成する4つの遺伝子（プレセニリン、ニカストリン、Aph-1、Pen2）とヒトアミロイド前駆体（APP）断片を酵母細胞内に導入した。これにより、（１）酵母の膜画分を調製し、試験管内でAβ生成活性を測定する。（２）酵母の生育を指標にγセクレターゼ活性を評価する。以上の２つの評価系を使って、Aβの生成に影響を及ぼす①反応条件、②サブユニットのアイソフォーム、③家族性アルツハイマー病変異、④薬剤の作用を解析し、⑤天然物ライブラリーからγセクレターゼ阻害剤を探索した。
また、BACE1安定発現HEK293細胞を用いて、BACE1阻害剤（新規KMI化合物）をスクリーニングした。
動物治療実験では、アルツハイマー病モデル（Tg2576）マウスにAβ発現米とNSAIDsを投与し（８～１１ヶ月齢）、その効果を、動物行動実験（Y迷路）により解析した。さらに、脳内での老人斑形成への効果について免疫組織染色により解析した。
結果と考察
①アルツハイマー病患者脳において減少するリン脂質プラズマローゲンによって、γセクレターゼが阻害され、Aβ生成へのプラズマローゲンの直接的な関与が証明された。
②プレセニリン２は、γセクレターゼ複合体の形成効率が著しく低く、プレセニリン１と比較して10分の1程度のAβ生成活性しかもたない事、③家族性アルツハイマー病のプレセニリン変異体は、野生型に比べて低いAβ生成活性しかもたないが毒性の高いAβ42の生成比率は上昇する事が明らかになった。④γセクレターゼモジュレーター（NSAIDs）はAβ分子種のうち、毒性の高いAβ42（数字はアミノ酸長）の生成量を大きく下げるが、カルボキシ末端を欠失するAPP断片の切断においてはその効果がみられず、APPのカルボキシ末端領域にNSAIDsが作用する可能性が示唆された。⑤天然物ライブラリーからスクリーニング総数1400のうち、57個を酵母の生育で選別し、実際にAβ生成系で阻害効果が見られた薬剤を１つ獲得した。スクリーニングによる問題点は、抗菌作用によって酵母が生育できない薬剤が多く、それによって多くの擬陽性が得られたことである。
β切断部位にフェニルノルスタチンを配した種々の新規KMI化合物から、脳内・細胞内への透過性や安定性における改善が期待される非ペプチド性化合物を見出した。
アルツハイマー病モデルマウス（Tg2576）の治療実験を行った。私たちが開発した食物ワクチン（Aβ米）とNSAIDsを併せて経口投与する効果を解析した。１１ヶ月齢時で、自発行動量・空間作業記憶の低下に対して、併用による改善効果が見られている。Aβ米投与群では老人斑が除去されたが、併用によりそれが促進するかについてはさらなる解析が必要である。
結論
酵母再構成系を用いて、γセクレターゼの酵素学的な性質を解明した。なかでも、プラズマローゲンとγセクレターゼの関連は、これまでには考えられていなかった全く新しい治療法開発への方向性を生み出した。また、γセクレターゼモジュレータNSAIDsの効果を検証し、APPのカルボキシ末端領域がNSAIDsの作用に必要であることを明らかにした。一方、BACE1阻害剤（新規KMI化合物）の改良、Aβ米とNSAIDsの併用によるモデルマウスの治療効果の促進など、アルツハイマー病治療に直結する成果をあげた。経口投与が可能な、比較的マイルドな療法の組み合わせによって最大限の効果を目指す方向性を提案したい。

公開日・更新日

公開日
2013-06-07
更新日
-

研究報告書（PDF）

行政効果報告

文献番号
201218007C

成果

専門的・学術的観点からの成果
アルツハイマー病の原因となるアミロイドβ（Aβ）の生成には、β、γセクレターゼの２つのプロテアーゼが関与する。私たちは、精製が困難で酵素機能が明らかになっていなかったヒトγセクレターゼ複合体を酵母において再構成し、Aβ産生活性を測定する系を世界で初めて開発した。これを用いて、①γセクレターゼのサブユニット種の違いによる活性の検討、②阻害剤の探索、③活性モジュレーター（抗炎症剤NSAIDsなど）の解析を行い、ほ乳類細胞を用いた解析では明らかにできなかったγセクレターゼの酵素学的性質を解明した。
臨床的観点からの成果
アルツハイマー病治療に直結する研究として、アルツハイマー病モデルマウス（Tg2576）の治療実験を行い、私たちが有効性を実証してきた経口ワクチン（Aβ米）とNSAIDsを投与したマウスにおいて、併用して治療することにより治療効果が促進することを明らかにした。一方、BACE1阻害剤（新規KMI化合物）の改良、低分子化にも成功し、アルツハイマー病治療に直結する成果をあげた。経口投与が可能な、比較的マイルドな療法の組み合わせによって最大限の効果を目指す方向性を提案したい。
ガイドライン等の開発
該当しない
その他行政的観点からの成果
該当しない
その他のインパクト
該当しない

発表件数

原著論文（和文）
3件
原著論文（英文等）
13件
その他論文(和文)
0件
その他論文(英文等)
2件
学会発表(国内学会)
7件
学会発表(国際学会等)
0件
その他成果(特許の出願)
0件
その他成果(特許の取得)
0件
その他成果(施策への反映)
0件
その他成果(普及・啓発活動)
0件

特許

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限ります。

原著論文1
Watahiki, H., Yagishita, S., Futai, E., and Ishiura, S.
CTF1-51, a truncated carboxyl-terminal fragment of amyloid precursor protein, suppresses the effects of Aβ-lowering γ-secretase modulators.
Neurosci. Lett. , 526 , 96-99  (2012)
原著論文2
Yonemura, Y., Futai, E., Yagishita, S., et al.
Comparison of presenilin 1 and presenilin 2 γ-secretase activities using a yeast reconstitution system.
J. Biol. Chem. , 286 , 44569-44575  (2011)
原著論文3
Nojima, J., Ishii-Katsuno, R., Futai, E., et al.
roduction of anti-amyloid β antibodies in mice fed rice expressing amyloid β.
Biosci. Biotechnol. Biochem. , 75 , 396-400  (2011)
原著論文4
Yoshida, T., Kimura, E., Koike, S., et al.
Transgenic rice expressing amyloid β-peptide for oral immunization.
Int. J. Biol. Sci. , 7 , 301-307  (2011)
原著論文5
Yamakawa, H., Yagishita, S., Futai, E. & Ishiura, S.
β-Secretase inhibitor potency is decreased by aberrant β-cleavage location of “Swedish mutant” amyloid precursor protein.
J. Biol. Chem. , 285 , 1634-1642  (2010)
原著論文6
Ishii-Katsuno, R., Nakajima, A., Katsuno, T., et al.
Reduction of amyloid beta peptide accumulation in Tg2576 transgenic mice by oral vaccination.
Biochem. Biophys. Res. Commun. , 399 , 593-599  (2010)
原著論文7
Hamada, Y., Nakanishi, T., Suzuki, K., et al.
Novel BACE1 inhibitors processing a 5-nitroisophthalic scaffold at the P2 position.
Bioorg. Med. Chem. Lett. , 22 , 4640-4644  (2012)
原著論文8
Hamada, Y., Tagad, H.D., Nishimura, Y., at al.
Tripeptidic BACE1 inhibitors devised by in-silico conformational structure-based design.
Bioorg. Med. Chem. Lett. , 22 , 1130-1135  (2012)
原著論文9
Asai, M., Iwata, N., Tomita, T., et al.
Efficient four-drug cocktail therapy targeting amyloid-β peptide for Alzheimer’s disease.
J. Neurosci. Res. , 88 , 3588-3597  (2010)

公開日・更新日

公開日
2015-06-10
更新日
2017-05-25

収支報告書

文献番号
201218007Z