small interfering RNA (siRNA)とリコンビナントArgonaute 2の同時細胞内導入による高効率な遺伝子発現抑制システムの開発

文献情報

• 文献番号: 201209012A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: small interfering RNA (siRNA)とリコンビナントArgonaute 2の同時細胞内導入による高効率な遺伝子発現抑制システムの開発
• 課題番号: H23-政策探索-若手-002
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 櫻井 文教(大阪大学大学院薬学研究科 分子生物学分野)

研究分担者(所属機関)

• 鈴木　亮(帝京大学薬学部　准教授)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（政策創薬探索研究）
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 5,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

siRNAは、その高い遺伝子発現抑制能から、次世代の革新的医薬として期待される。しかし、①十分量のsiRNAを細胞内導入できても、細胞内Ago2量が足りず、十分に遺伝子発現抑制されない、②標的以外の遺伝子の発現を抑制してしまう（off-target効果）ことが問題となっている。そこで本研究では、我が国独自のDDS技術を用いて、siRNAとともにリコンビナントAgo2を細胞内導入し、低用量で高効率に遺伝子発現抑制可能なシステムを開発することを試みた。今年度は、一般のタンパク質導入試薬を用いてリコンビナントAgo2を導入することで、ノックダウン効率の向上を試みた。さらに、Ago2に核移行シグナルを付与することで、核に局在する非コードRNAを高効率にノックダウンすることを試みた。また、バブルリポソームと超音波照射により、タンパク質を高効率に導入することを試みた。

研究方法

市販のタンパク質導入試薬であるBioporterを用いてリコンビナントAgo2をルシフェラーゼ安定発現細胞に導入するとともに、ルシフェラーゼに対するsiRNAをRNAiMAXを用いて導入し、ノックダウン効率を検討した。コントロールとしてb-galactosidaseを用いた。また、核局在性の非コードRNAであるHOTAIRを高効率にノックダウンすることを目的に、SV40 large T antigenの核移行シグナルを付与したAgo2を発現させることを試みた。また、バブルリポソームと超音波照射を用いて、b-galactosidaseを培養細胞に導入することを試みた。

結果と考察

siRNAとともにリコンビナントAgo2を細胞内に導入することで、b-galactosidaseを導入した場合と比較し、ノックダウン効率の向上が観察された。しかし、siRNAのみを導入した群と比較するとノックダウン効率が低下しており、2回トランスフェクションすることによる毒性が問題と考えられた。また核移行シグナルをAgo2に付与した場合、この変異型Ago2の発現効率は野生型Ago2と比較して低いものであった。野生型Ago2の細胞内局在を検討したところ、野生型Ago2でも細胞質のみならず核にも局在しており、野生型Ago2を過剰発現させることで核局在性のRNAも高効率にノックダウン可能であった。またバブルリポソームと超音波照射の併用により、b-galactosidaseを培養細胞に導入することに成功した。しかしその導入効率は市販のタンパク質導入試薬と比較して低いものであった。

結論

本研究により、細胞内のAgo2量を増加させることでsiRNAによるノックダウン効率を向上可能であることが明らかとなった。また核局在性のRNAもAgo2の過剰発現により、高効率にノックダウン可能であった。しかしAgo2発現プラスミドの導入と比較し、リコンビナントAgo2の導入では毒性が高く改善が必要であった。またバブルリポソームおよび超音波照射によるタンパク質導入法の確立に成功したが、高効率なノックダウンに向けては更なる改善が求められる。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-09-01
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201209012B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: small interfering RNA (siRNA)とリコンビナントArgonaute 2の同時細胞内導入による高効率な遺伝子発現抑制システムの開発
• 課題番号: H23-政策探索-若手-002
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 櫻井 文教(大阪大学大学院薬学研究科 分子生物学分野)

研究分担者(所属機関)

• 鈴木　亮(帝京大学　薬学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（政策創薬探索研究）
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

siRNAは、その高い遺伝子発現抑制能から、次世代の革新的医薬として期待される。しかし、①十分量のsiRNAを細胞内導入できても、細胞内Ago2量が足りず、十分に遺伝子発現抑制されない、②標的以外の遺伝子の発現を抑制してしまうことが問題となっている。そこで本研究では、我が国独自のDDS技術を用いて、siRNAとともにリコンビナントAgo2を細胞内導入し、低用量で高効率に遺伝子発現抑制可能なシステムを開発することを試みた。

研究方法

まず各種RNA干渉関連因子を過剰発現させたのちsiRNAを細胞内に導入し、ノックダウン効率を測定することで、どの因子がノックダウン効率向上に向けて重要か検討した。次に、市販の各種タンパク質導入試薬のタンパク質導入効率を比較するとともに、最も高い導入効率を示したものを用いてリコンビナントAgo2を導入し、ノックダウン効率が向上するか検討した。さらに、核移行シグナルを付与したAgo2を強制発現させ、核局在性の非コードRNAに対するノックダウン効率を向上させることを試みた。またバブルリポソームおよび超音波照射を併用することにより、siRNAおよびタンパク質の高効率導入法の開発を試みた。

結果と考察

各種RNA干渉関連因子のうち、Ago2を過剰発現させることでノックダウン効率を向上可能であることが明らかとなった。リコンビナントAgo2を市販のタンパク質導入試薬のなかで最も導入効率に優れたBioporterを用いて導入したところ、コントロールであるb-galactosidaseを導入した場合と比較し、ノックダウン効率の向上が観察された。しかし、siRNA単独群と比較するとむしろノックダウン効率は低下しており、トランスフェクション試薬による毒性の影響が考察された。核移行シグナルをAgo2に付与するとタンパク質発現量が大きく減少し、核局在性のRNAも野生型Ago2を過剰発現させることでノックダウン効率を上昇させることが可能であった。またバブルリポソームと超音波照射を用いて、siRNAおよびタンパク質の細胞内導入を改善することに成功した。

結論

Ago2は高効率なノックダウンに向けて極めて重要な因子であり、細胞内のAgo2量を増やすことでノックダウン効率を改善することに成功した。またリコンビナントAgo2の細胞内導入においては、毒性がひくく導入効率の高い方法の開発が期待される。バブルリポソームおよび超音波照射の併用によりsiRNAおよびタンパク質の細胞内導入に成功したが、更なる改善が求められる。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-09-01
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201209012C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究では、siRNAとともにAgo2を過剰発現させることでノックダウン効率を向上可能であること、Ago2が細胞質のみならず核にも局在し、核に存在するRNAもノックダウン可能であること、バブルリポソームと超音波の併用によってタンパク質を細胞内にデリバリー可能であることを明らかにした。本成果は、高効率なRNA干渉の誘導に向けて極めて有用と期待される。
• 臨床的観点からの成果: RNA干渉を誘導するsiRNAは次世代の革新的医薬品として期待されているが、高い治療効果を得るためには高いノックダウン効率を誘導することが必要不可欠である。本研究では、細胞内のAgo2量がノックダウン効率を決める重要な要因であり、Ago2を過剰発現させることでノックダウン効率を向上させることが可能であることを明らかにした。今後、siRNAの臨床応用の際には、細胞内Ago2量が治療効果予測に向けたマーカーをなりえる可能性がある。
• ガイドライン等の開発: 該当なし
• その他行政的観点からの成果: 該当なし
• その他のインパクト: 該当なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 16件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 26件
• 学会発表(国際学会等): 4件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Omata D, Negishi Y, Hagiwara S et al.; Bubble Liposomes and Ultrasound Promoted Endosomal Escape of TAT-PEG Liposomes as Gene Delivery Carriers; Mol Pharm , 8 , 2416-2423 (2011)
• 原著論文2: Un K, Kawakami S, Higuchi Y et al.; Involvement of activated transcriptional process in efficient gene transfection using unmodified and mannose-modified bubble lipoplexes with ultrasound exposure; J Control Rel , 156 , 355-363 (2011)
• 原著論文3: Shiraishi K, Endoh R, Furuhata H et al.; A facile preparation method of a PFC-containing nano-sized emulsion for theranostics of solid tumors; Int J Pharm , 421 , 379-387 (2011)
• 原著論文4: Un K, Kawakami S, Suzuki R et al.; Suppression of Melanoma Growth and Metastasis by DNA Vaccination Using an Ultrasound-Responsive and Mannose-Modified Gene Carrier; Mol Pharm , 8 , 543-554 (2011)
• 原著論文5: Negishi Y, Matsuo K, Endo-Takahashi Y et al.; Delivery of an Angiogenic Gene into Ischemic Muscle by Novel Bubble Liposomes Followed by Ultrasound Exposure; Pharm Res , 28 , 712-719 (2011)
• 原著論文6: Hagisawa K, Nishioka T, Suzuki R et al.; Enhancement of ultrasonic thrombus imaging using novel liposomal bubbles targeting activated platelet glycoprotein IIb/IIIa complex-in vitro and in vivo study; Int J Cardiol , 152 , 202-206 (2011)
• 原著論文7: Negishi Y, Hamano N, Shiono H et al.; The development of an ultrasound-mediated nucleic acid delivery system for treating muscular dystrophies.; Yakugaku Zasshi , 132 , 1383-1388 (2012)
• 原著論文8: Matsui A, Yokoo H, Negishi Y et al.; CXCL17 expression by tumor cell recruits CD11b+Gr1 high F4/80-cells and promotes tumor progression.; PLoS One , 7 , e44080- (2012)
• 原著論文9: Negishi Y, Endo-Takahashi Y, Matsuki Y et al.; Systemic delivery systems of angiogenic gene by novel bubble liposomes containing cationic lipid and ultrasound exposure.; Mol. Pharm. , 9 , 1834-1840 (2012)
• 原著論文10: Sonoda S, Tachibana K, Yamashita T et al.; Selective gene transfer to the retina using intravitreal ultrasound irradiation.; J. Ophthalmol. , 2012 , 412752- (2012)
• 原著論文11: Omata D, Negishi Y, Yamamura S et al.; Involvement of Ca2+ and ATP in enhanced gene delivery by bubble liposomes and ultrasound exposure.; Mol. Pharm. , 9 , 1017-1023 (2012)
• 原著論文12: Omata D, Negishi Y, Hagiwara S et al.; Enhanced gene delivery using Bubble liposomes and ultrasound for folate-PEG liposomes.; J. Drug Target. , 20 , 355-363 (2012)
• 原著論文13: Un K, Kawakami S, Yoshida M et al.; Efficient suppression of murine intracellular adhesion molecule-1 using ultrasound-responsive and mannose-modified lipoplexes inhibits acute hepatic inflammation.; Hepatology , 56 , 259-269 (2012)
• 原著論文14: Oda Y, Suzuki R, Otake S, et al.; Prophylactic immunization with Bubble liposomes and ultrasound-treated dendritic cells provided a four-fold decrease in the frequency of melanoma lung metastasis.; J. Control. Release , 160 , 362-366 (2012)
• 原著論文15: Endo-Takahashi Y, Negishi Y, Kato Y et al.; Efficient siRNA delivery using novel siRNA-loaded Bubble liposomes and ultrasound.; Int. J. Pharm. , 422 , 504-509 (2012)
• 原著論文16: Sugano M, Negishi Y, Endo-Takahashi Y et al.; Gene delivery system involving Bubble liposomes and ultrasound for the efficient in vivo delivery of genes into mouse tongue tissue.; Int. J. Pharm. , 422 , 332-337 (2012)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-27
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201209012Z