MLL-AF4白血病の分子標的薬創製を目指したAF4特異的な分解経路の解明

文献情報

• 文献番号: 201209011A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: MLL-AF4白血病の分子標的薬創製を目指したAF4特異的な分解経路の解明
• 課題番号: H23-政策探索-若手-001
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 横山 明彦(京都大学 医学(系）研究科（研究院）)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（政策創薬探索研究）
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 5,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

多くの乳児白血病が現行の治療法でよく治癒する中で、MLL-AF4融合遺伝子を発現する急性リンパ性白血病は生存率が悪く、新規の治療法が求められている。我々は白血病を起こすMLL-AF4タンパク質が多くの細胞で未知の分解経路を介して特異的に分解される事を見いだした。さらに、実際にMLL-AF4はこの分解経路が活性化されている骨髄系の細胞では白血病を引き起こさない事をマウス白血病モデルでも検証した。この事はリンパ性のMLL-AF4白血病細胞中でこの分解経路を活性化する事ができれば、MLL-AF4白血病を根絶できる事を示唆している。本研究は、将来的にMLL-AF4を特異的に分解するような分子標的薬の創製を見据え、AF4特異的な分解経路の全容を明らかにする事を目指す。平成２４年度において、我々はAF4の不安定化ドメインに特異的に結合するタンパク質の同定を目指した。

研究方法

我々は平成２３年度までに、様々なMLL-AF4の変異体を作成し、そのタンパク質の発現や骨髄前駆細胞を不死化する活性を調べる事で、まずAF4特異的な分解に必要な130残基程の最小ドメイン構造（A4DD）を決定した。この不安定化ドメインにFLAG tagをつけた蛋白質を一過性に発現させ、抗FLAG抗体を用いたaffinity精製にて結合するタンパク質を精製する。その後、精製物を質量分析装置にて解析し、結合タンパク質を同定する。

結果と考察

我々はAF4のC末端部分(AF4-4)とそのA4DD部分を安定なAF5q31の配列で置き換えた安定化変異体(AF4-4Bc)を一過性に発現させ、抗FLAG抗体を用いたaffinity精製を行った。得られた精製物の質量分析を行ったところ、様々な蛋白質が同定された。しかし、同定したAF4特異的結合因子の中で、蛋白質の分解に関わると予想されるものはなかった。一方、AF4-4Bc特異的に結合する蛋白質の一つが脱ユビキチン化活性を持つ事から、AF4-4が分解され易く、AF4-4Bcが分解されにくいのは脱ユビキチン化酵素がAF5q31特異的に結合し、ユビキチンープロテオソーム経路を介した分解を抑制している可能性が考えられた。これらの結果から、A4DDを認識して特異的に分解する蛋白質は存在せず、モチーフの構造そのものが、正常な折りたたみがされにくいものであり、多くの細胞では成熟した蛋白質として産生されずに、分解されているという事が考えられる。その場合、リンパ系の細胞で特異的に発現する分子シャペロンのようなものが、リンパ系特異的に機能的なAF4の産生を可能にしているのかもしれない。

結論

AF4特異的な分解経路を同定する目的で、AF4の不安定化モチーフに特異的に結合する蛋白質を探索した結果、幾つかの蛋白質が同定されたが、それらの多くはDNA repairやDNA metabolismに関するものが多く、蛋白質分解に関与する事がわかっているものは含まれていなかった。一方、不安定化されないAF5q31のA4DD相当部分に結合する蛋白質が同定された。そのうちの一つは脱ユビキチン化酵素であり、この分子は蛋白質分解の目印であるユビキチンを切断する活性を持つ事から、蛋白質分解を抑制する働きがあると考えられる。これらの結果から、AF4の不安定化はA4DD構造の折りたたまれ難さに起因するものであり、AF4以外のAF4 family蛋白質は同様の構造を持つ一方で、特定の蛋白質と相互作用する事で分解から逃れている可能性が示唆された。AF4がリンパ系の細胞で機能するためには、リンパ系においてAF4を安定化する因子が存在するのかもしれない。今後はリンパ系の細胞で特異的にA4DDと作用して安定化する因子の探索を進めるべきである事が明らかになった。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-09-01
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201209011B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: MLL-AF4白血病の分子標的薬創製を目指したAF4特異的な分解経路の解明
• 課題番号: H23-政策探索-若手-001
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 横山 明彦(京都大学 医学(系）研究科（研究院）)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（政策創薬探索研究）
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

多くの乳児白血病が現行の治療法でよく治癒する中で、MLL-AF4融合遺伝子を発現する急性リンパ性白血病は生存率が悪く、新規の治療法が求められている。我々は白血病を起こすMLL-AF4タンパク質が多くの細胞で未知の分解経路を介して特異的に分解される事を見いだした。さらに、実際にMLL-AF4はこの分解経路が活性化されている骨髄系の細胞では白血病を引き起こさない事をマウス白血病モデルでも検証した。この事はリンパ性のMLL-AF4白血病細胞中でこの分解経路を活性化する事ができれば、MLL-AF4白血病を根絶できる事を示唆している。本研究は、将来的にMLL-AF4を特異的に分解するような分子標的薬の創製を見据え、AF4特異的な分解経路の全容を明らかにする事を目指す。

研究方法

我々は難治性の乳児白血病を引き起こすMLL-AF4タンパク質が多くの組織・細胞でAF4特異的な分解経路によって分解される事を見いだした。長期的にはこの分解経路を利用した分子標的療法を開発する事を見据え、この分解経路の解明を試みる。そのために、様々なMLL-AF4の変異体を作成し、そのタンパク質の発現や骨髄前駆細胞を不死化する活性を調べる事で、まずAF4の不安定化に必要な最小ドメインを決定する。次に、この不安定化ドメインに結合するタンパク質を同定する事を試みる。具体的には細胞内にAF4不安定化ドメインを一過性に発現させ、不安定化ドメインとその結合因子の複合体をワンステップアフィニティー精製法にて精製する。その後、精製物の質量分析を行い、結合因子を同定する。

結果と考察

我々は当初の計画通り平成２３年度中に、AF4特異的な分解に必要な130残基程の最小ドメイン構造（A4DD）を決定した。さらに、我々はこのドメインを持つタンパク質がリンパ系の細胞株であるBa/F3細胞では安定して発現する事を見いだした。これらの結果はMLL-AF4がリンパ系では安定で骨髄系では不安定であるという知見を支持する。平成２４年度には、A4DDに特異的に結合するタンパク質の同定を試みた。我々は293T細胞は骨髄系の細胞ではないが、AF4が不安定化される事を見いだしていた。そこで、293T細胞に一過性にAF4を発現させ、ワンステップアフィニティー精製法にて精製することで、共作用因子を同定する手法を採用した。得られた精製物の質量分析を行ったところ、様々な蛋白質が同定された。しかし、同定したAF4特異的結合因子の中で、蛋白質の分解に関わると予想されるものはなかった。一方、AF4には結合しないが安定なAF5q31特異的に結合する蛋白質の一つが脱ユビキチン化活性を持つ事が分かった。この事から、AF5q31が分解されにくいのは脱ユビキチン化酵素が特異的に結合し、ユビキチンープロテオソーム経路を介した分解を抑制している可能性が考えられた。これらの結果から、A4DDを認識して特異的に分解する蛋白質は存在せず、モチーフの構造そのものが、正常にフォールディングし難いものであり、多くの細胞では成熟した蛋白質として産生されずに、分解されているという事が考えられた。その場合、リンパ系の細胞で特異的に発現する分子シャペロンのようなものが、リンパ系特異的に機能的なAF4の産生を可能にしているのかもしれない。

結論

平成２３年度に得られた結果から，当初の仮説の通り、MLL-AF4は骨髄系では不安定化を受けており、リンパ系では受けていないと結論する。AF4特異的な分解経路を同定する目的で、AF4の不安定化モチーフに特異的に結合するタンパク質を探索した結果、幾つかのタンパク質が同定されたが、それらの多くはDNA repairやDNA metabolismに関するものが多く、タンパク質分解に関与する事がわかっているものは含まれていなかった。一方、不安定化されないAF5q31のA4DD相当部分に脱ユビキチン化酵素結合する事が明らかになった。これらの結果から、AF4の不安定化はA4DD構造の折りたたまれ難さに起因するものであり、AF4以外のAF4 family蛋白質は同様の構造を持つ一方で、特定の蛋白質と相互作用する事で分解から逃れている可能性が示唆された。AF4がリンパ系の細胞で機能するためには、リンパ系においてAF4を安定化する因子が存在するのかもしれない。今後はリンパ系の細胞で特異的にA4DDと作用して安定化する因子の探索を進めるべきである事が明らかになった。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-09-01
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201209011C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: MLL白血病において最も高頻度に形成される変異遺伝子であるMLL-AF4融合遺伝子が細胞種特異的に分解制御を受けるメカニズムの解析に取り組み、MLL-AF4がリンパ系の細胞では安定的に発現するが、骨髄系の細胞では発現しない事を示した。さらに、不安定化を引き起こす最小不安定化ドメインを同定し、その構造に特異的に結合する因子を探索した。不安定化されるAF4に特異的に結合する因子は同定できなかったが、安定なAF5 q 31に含まれる同様の構造に特異的に結合し蛋白分解を制御する因子を同定した。
• 臨床的観点からの成果: MLL-AF4融合蛋白質を発現する白血病は乳児に多く予後が非常に悪い。MLL-AF4タンパク質が細胞種によっては分解される事を見いだし、その分解機序を解析した。その結果、AF4には非常にフォールディングされ難い構造があり、この構造に作用してフォールディングを助ける分子シャペロン的な働きを持つ因子が存在する可能性が示唆された。今後そのような因子を同定し、治療薬となるような阻害剤を開発することを目指す上で、重要な知見が得られた。
• ガイドライン等の開発: 該当しない
• その他行政的観点からの成果: 多くの乳児白血病が現行の治療法でよく治癒する中で、MLL-AF4融合遺伝子を発現する急性リンパ性白血病は生存率が悪い。このため、新規の治療法を開発する事が社会的な要請になっているが、現状は、なかなか有効な治療法が出てきていない。申請者は独自の知見に基づいてMLL-AF4を不活性化する薬剤の開発を目指し、MLL-AF4タンパク質の安定性の制御メカニズムに関する知見を得た。
• その他のインパクト: 特になし

発表件数

• 原著論文（和文）: 1件
• 原著論文（英文等）: 0件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 2件
• 学会発表(国際学会等): 1件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-27
• 更新日: 2017-06-20

収支報告書

• 文献番号: 201209011Z