文献情報
文献番号
199800048A
報告書区分
総括
研究課題名
慢性糸球体腎炎の遺伝子治療に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
横尾 隆(東京慈恵会医科大学内科学講座第2)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生科学研究費補助金 行政政策研究分野 厚生科学特別研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
-
研究費
2,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
これまでの多くの研究により特定の遺伝子を糸球体に導入することによ
る糸球体腎炎治療の可能性は示唆され、糸球体に特異的かつ効果的に遺伝子を導入
する方法の開発が進んでいるものの未だに多くの問題点を抱えている。そのひとつ
は糸球体腎炎の特徴としてその進行度がそれぞれの糸球体でまちまちであることで
あり、炎症が進行した部位とほとんど正常に近い部位とが混在することが多く見ら
れる。そこで炎症の部位及び時期に特異的に遺伝子を導入することが必要となる。
今回我々は炎症部位に発現する接着分子ICAM-1に注目し、このリガンドを持った細
胞を担体とし炎症部位に特異的に遺伝子を導入する方法の開発を試みた。さらにこ
のシステムを用い、炎症糸球体に抗炎症性サイトカインを導入し糸球体腎炎進行を
抑止させ得るか検討した。
る糸球体腎炎治療の可能性は示唆され、糸球体に特異的かつ効果的に遺伝子を導入
する方法の開発が進んでいるものの未だに多くの問題点を抱えている。そのひとつ
は糸球体腎炎の特徴としてその進行度がそれぞれの糸球体でまちまちであることで
あり、炎症が進行した部位とほとんど正常に近い部位とが混在することが多く見ら
れる。そこで炎症の部位及び時期に特異的に遺伝子を導入することが必要となる。
今回我々は炎症部位に発現する接着分子ICAM-1に注目し、このリガンドを持った細
胞を担体とし炎症部位に特異的に遺伝子を導入する方法の開発を試みた。さらにこ
のシステムを用い、炎症糸球体に抗炎症性サイトカインを導入し糸球体腎炎進行を
抑止させ得るか検討した。
研究方法
マウス(DBA/2)の骨髄細胞を大腿骨、脛骨より採取し、CSF-1等の単核
球系に分化誘導しやすい因子を多く含むL-929細胞上清含有培地にて7日間培養する
。この培養の間に骨髄細胞は炎症部位に誘導される接着分子ICAM-1のリガンドであ
るCD11b及びCD18陽性になることをflow cytometerにて確認する。subclone化したこ
れらの細胞群(担体細胞)をfluorescent lipophilic probeにてラベルし、
DBA/2Jマウスに尾静脈を介して戻す。その上で糸球体でのICAM-1の発現を高めるた
めにlipopolysaccharide(LPS)の腹腔内投与を7日間にわたりくり返す。Day 0,
1, 2, 4, 7, 9, 11, 28, 34, 56, 63日目にマウスより腎臓を摘出し、糸球体への担
体細胞の集積を蛍光顕微鏡を用い検索する。さらに免疫組織科学的手法を用い、
ICAM-1の発現レベルとの相関性について検討する。次にこのICAM-1による制御がど
れくらいの期間持続するか確認するために7日間のLPSの投与を担体細胞導入後4週
、8週後にも同様に行い、糸球体に集積するか検討した。これらの結果を基にこの
担体細胞にレポーター遺伝子を導入し、実際に遺伝子の運び屋として機能するか確
認した。骨髄細胞を採取,36時間pre-incubationした後、human
b-galactosidase(GC)を発現する組換えレトロウイルスベクターMFGのproducer細胞
株の培養上清を加え感染させた。このレポーター遺伝子を持った担体細胞をマウス
に戻し、LPSまたは生理食塩水の腹腔内投与をくり返し糸球体でのICAM-1の発現を誘
導した。human specific GC sequenceを検出するpolymerase chain
reaction(PCR)及び単離糸球体のGC bioassayを施行し、実際に炎症糸球体にGC 遺伝
子が導入されているか確認した。
続いて次にこのシステムを用いた治療への適応性について検討した。DBA/2Jマウス
の骨髄から得た担体細胞にアデノウイルスを用いて抗炎症性サイトカインであるマ
ウスInterleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra)遺伝子を導入した。ウエスタン
ブロット法を用いこれらのIL-1ra遺伝子導入担体細胞が効率良くIL-1raを発現して
いることを確認後、ラビットIgG及びcomplete Freund's adjuvant にて前感作した
DBA/2Jマウスに尾静脈を介し戻した。コントロールとしてGC遺伝子を導入した
mock transfectantを使用した。24時間後これらのマウスに抗基底膜抗体を投与し糸
球体腎炎を励起させ、尿蛋白排泄量、血清クレアチニン値、及び腎組織学的所見の
差について経時的に検討した。
球系に分化誘導しやすい因子を多く含むL-929細胞上清含有培地にて7日間培養する
。この培養の間に骨髄細胞は炎症部位に誘導される接着分子ICAM-1のリガンドであ
るCD11b及びCD18陽性になることをflow cytometerにて確認する。subclone化したこ
れらの細胞群(担体細胞)をfluorescent lipophilic probeにてラベルし、
DBA/2Jマウスに尾静脈を介して戻す。その上で糸球体でのICAM-1の発現を高めるた
めにlipopolysaccharide(LPS)の腹腔内投与を7日間にわたりくり返す。Day 0,
1, 2, 4, 7, 9, 11, 28, 34, 56, 63日目にマウスより腎臓を摘出し、糸球体への担
体細胞の集積を蛍光顕微鏡を用い検索する。さらに免疫組織科学的手法を用い、
ICAM-1の発現レベルとの相関性について検討する。次にこのICAM-1による制御がど
れくらいの期間持続するか確認するために7日間のLPSの投与を担体細胞導入後4週
、8週後にも同様に行い、糸球体に集積するか検討した。これらの結果を基にこの
担体細胞にレポーター遺伝子を導入し、実際に遺伝子の運び屋として機能するか確
認した。骨髄細胞を採取,36時間pre-incubationした後、human
b-galactosidase(GC)を発現する組換えレトロウイルスベクターMFGのproducer細胞
株の培養上清を加え感染させた。このレポーター遺伝子を持った担体細胞をマウス
に戻し、LPSまたは生理食塩水の腹腔内投与をくり返し糸球体でのICAM-1の発現を誘
導した。human specific GC sequenceを検出するpolymerase chain
reaction(PCR)及び単離糸球体のGC bioassayを施行し、実際に炎症糸球体にGC 遺伝
子が導入されているか確認した。
続いて次にこのシステムを用いた治療への適応性について検討した。DBA/2Jマウス
の骨髄から得た担体細胞にアデノウイルスを用いて抗炎症性サイトカインであるマ
ウスInterleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra)遺伝子を導入した。ウエスタン
ブロット法を用いこれらのIL-1ra遺伝子導入担体細胞が効率良くIL-1raを発現して
いることを確認後、ラビットIgG及びcomplete Freund's adjuvant にて前感作した
DBA/2Jマウスに尾静脈を介し戻した。コントロールとしてGC遺伝子を導入した
mock transfectantを使用した。24時間後これらのマウスに抗基底膜抗体を投与し糸
球体腎炎を励起させ、尿蛋白排泄量、血清クレアチニン値、及び腎組織学的所見の
差について経時的に検討した。
結果と考察
骨髄細胞をL929細胞上清にて七日間培養することによってICAM-1のリ
ガンドのCD11b, CD18の陽性率が12.7±3.4%から99.1±0.9%になることがflow
cytometerにて確認されたためこれらをラベルし、マウスに尾静脈を介して戻したう
えで糸球体でのICAM-1の発現を高めるためlipopolysaccharide (LPS)の腹腔内投与
をくりかえしたところ、投与開始後24時間で担体細胞が糸球体に集積しはじめ(
0.73±0.10/gcs)、投与終了した一週間後まで徐々に増え(1.47±0.19/gcs)、そ
の後消失した。一方同量の生理食塩水を腹腔内投与されたコントロールマウスでは
、担体細胞の集積はほとんどみられなかった(0.05±0.03/gcs)。このLPSで制御さ
れる担体細胞の糸球体への集積は、4週、8週後にもみられた。更に免疫組織科学
的解析によりこの担体細胞の糸球体への集積はICAM-1の発現部位及び発現レベルと
相関していることが確認された。
このICAM-1の発現で制御される担体細胞が実際に遺伝子を運ぶことができるか調べ
た実験ではLPS投与し、ICAM-1の糸球体での発現を高めた群の単離糸球体は有意に強
いGC活性がみられ、さらにpolymerase chain reaction(PCR)を用いた実験では、遺
伝子導入した担体細胞を静脈注射したマウスにのみhuman specific GC sequenceが
存在していることが確認された。更にこのシステムの腎毒性についても検討したと
ころ担体細胞の再注入はLPSの一週間投与を併用しても明らかな蛋白尿増加効果や血
清中クレアチニン増加効果を認めなかった。以上より腎毒性のない炎症部位特異的
な糸球体への遺伝子導入法が確立されたことが示された。
このシステムを用い抗炎症性サイトカインのIL-1raをマウスに導入し、抗基底膜抗
体を投与することによって糸球体に炎症を惹起させたところ、mock細胞を投与した
群においては多量のアルブミン尿を認めたが、IL-1ra産生vehicle cellを投与した
群ではこれらのアルブミン尿は優位に抑制された。(220.8±76.8 mg/day in
IL-1ra treated mice vs. 1.34±0.10 mg/dl in mock treated mice at day 14)。
また血中クレアチニンレベルもIL-1ra遺伝子導入群ではコントロールと比較し有意
に低値であった(0.62±0.08 mg/dl in IL-1ra treated mice vs. 1.34±0.10
mg/dl in mock treated mice)。組織学検討でも抗GBM抗体投与14日目に半月体形
成率がIL-1ra投与群に有意に低下していた。
蛍光色素にてラベルしたvehicle cellを用いた実験により、抗基底膜抗体投与3日目
にはvehicle cellが有意に糸球体に集積していることが確認され、またこれらの糸
球体を単離し培養したところIL-1ra産生vehicle cellを投与した群の糸球体では培
養上清中に多量のIL-1raが分泌されていることが確認された。一方両群の血清中に
はIL-1raはウエスタンブロット法で検出できる範囲の誘導は見られなかった。これ
らの結果は、IL-1ra産生vehicle cellの投与による抗GBM抗体誘導腎炎の抑制は
vehicle cellの糸球体局所でのIL-1ra産生に寄与していることを示唆するものと思
われる。
ガンドのCD11b, CD18の陽性率が12.7±3.4%から99.1±0.9%になることがflow
cytometerにて確認されたためこれらをラベルし、マウスに尾静脈を介して戻したう
えで糸球体でのICAM-1の発現を高めるためlipopolysaccharide (LPS)の腹腔内投与
をくりかえしたところ、投与開始後24時間で担体細胞が糸球体に集積しはじめ(
0.73±0.10/gcs)、投与終了した一週間後まで徐々に増え(1.47±0.19/gcs)、そ
の後消失した。一方同量の生理食塩水を腹腔内投与されたコントロールマウスでは
、担体細胞の集積はほとんどみられなかった(0.05±0.03/gcs)。このLPSで制御さ
れる担体細胞の糸球体への集積は、4週、8週後にもみられた。更に免疫組織科学
的解析によりこの担体細胞の糸球体への集積はICAM-1の発現部位及び発現レベルと
相関していることが確認された。
このICAM-1の発現で制御される担体細胞が実際に遺伝子を運ぶことができるか調べ
た実験ではLPS投与し、ICAM-1の糸球体での発現を高めた群の単離糸球体は有意に強
いGC活性がみられ、さらにpolymerase chain reaction(PCR)を用いた実験では、遺
伝子導入した担体細胞を静脈注射したマウスにのみhuman specific GC sequenceが
存在していることが確認された。更にこのシステムの腎毒性についても検討したと
ころ担体細胞の再注入はLPSの一週間投与を併用しても明らかな蛋白尿増加効果や血
清中クレアチニン増加効果を認めなかった。以上より腎毒性のない炎症部位特異的
な糸球体への遺伝子導入法が確立されたことが示された。
このシステムを用い抗炎症性サイトカインのIL-1raをマウスに導入し、抗基底膜抗
体を投与することによって糸球体に炎症を惹起させたところ、mock細胞を投与した
群においては多量のアルブミン尿を認めたが、IL-1ra産生vehicle cellを投与した
群ではこれらのアルブミン尿は優位に抑制された。(220.8±76.8 mg/day in
IL-1ra treated mice vs. 1.34±0.10 mg/dl in mock treated mice at day 14)。
また血中クレアチニンレベルもIL-1ra遺伝子導入群ではコントロールと比較し有意
に低値であった(0.62±0.08 mg/dl in IL-1ra treated mice vs. 1.34±0.10
mg/dl in mock treated mice)。組織学検討でも抗GBM抗体投与14日目に半月体形
成率がIL-1ra投与群に有意に低下していた。
蛍光色素にてラベルしたvehicle cellを用いた実験により、抗基底膜抗体投与3日目
にはvehicle cellが有意に糸球体に集積していることが確認され、またこれらの糸
球体を単離し培養したところIL-1ra産生vehicle cellを投与した群の糸球体では培
養上清中に多量のIL-1raが分泌されていることが確認された。一方両群の血清中に
はIL-1raはウエスタンブロット法で検出できる範囲の誘導は見られなかった。これ
らの結果は、IL-1ra産生vehicle cellの投与による抗GBM抗体誘導腎炎の抑制は
vehicle cellの糸球体局所でのIL-1ra産生に寄与していることを示唆するものと思
われる。
結論
これまでの慢性糸球体腎炎の治療法としてステロイド剤や、免疫抑制剤、抗
血小板療法等が古くから用いられているがその治療効果が必ずしも有効とはいえず
、革新的な治療法の開発が待たれている。我々の開発した接着分子をマ-カーにし
た炎症部位特異的ex vivo遺伝子導入法は、1)炎症糸球体に特異的に遺伝子を導入
することが可能。2)末梢血管から投与できるので繰り返し投与が可能となり、ま
た侵襲が少ない。3)遺伝子導入に伴って腎機能低下を生じることがほとんどない
。4)1回投与で比較的長期に制御が可能となる。5)自家骨髄を使用することが
可能なため、免疫反応を惹起させずに繰り返し導入が可能。等の特徴を持ち、一部
の糸球体腎炎進行を一定期間抑止することが可能であることが示めされ、今後シス
テムの改良によって遺伝子治療が糸球体腎炎の新しい治療戦略となり得ることが期
待される。
血小板療法等が古くから用いられているがその治療効果が必ずしも有効とはいえず
、革新的な治療法の開発が待たれている。我々の開発した接着分子をマ-カーにし
た炎症部位特異的ex vivo遺伝子導入法は、1)炎症糸球体に特異的に遺伝子を導入
することが可能。2)末梢血管から投与できるので繰り返し投与が可能となり、ま
た侵襲が少ない。3)遺伝子導入に伴って腎機能低下を生じることがほとんどない
。4)1回投与で比較的長期に制御が可能となる。5)自家骨髄を使用することが
可能なため、免疫反応を惹起させずに繰り返し導入が可能。等の特徴を持ち、一部
の糸球体腎炎進行を一定期間抑止することが可能であることが示めされ、今後シス
テムの改良によって遺伝子治療が糸球体腎炎の新しい治療戦略となり得ることが期
待される。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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