貧血用漢方薬の作用メカニズム解析と有効成分の同定

文献情報

• 文献番号: 201208006A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 貧血用漢方薬の作用メカニズム解析と有効成分の同定
• 課題番号: H22-創薬総合-一般-006
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 杉山 大介(九州大学大学院医学研究院 先端医療医学部門先端医療医学講座造血幹細胞分野)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（創薬総合推進研究）
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 12,800,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

血液学の分野においては、漢方薬の効果をもたらす分子メカニズムはほとんど明らかにされていない。すでに平成22-23年度に貧血用漢方薬として代表的な四物湯類をマウス造血細胞へ添加培養し、細胞増殖を指標に造血へ与える影響を検討した。また人参養栄湯の有効成分同定を試みた。赤血球造血に加え、白血球造血を亢進しており、その機序として、抗アポトーシス効果と骨髄球分化促進による事を分子生物学的に明らかにした。人参養栄湯の造血に与える影響をさらに明らかにするため、平成24年度は、マイクロアレイ法により得られた候補分子の遺伝子発現の変化を、in vitro並びにin vivoで解析することを目的とした。また人参養栄湯のmiRNA合成の影響も検討を行った。

研究方法

漢方薬の調整、骨髄細胞の単離と培養、フローサイトメトリーによる血球分化評価、遺伝子発現解析は平成22,23年度と同様の方法で行った。DNAマイクロアレイ（アジレントテクノロジー社）後のin silico解析はDAVIDを用いて分類解析を行った。In vivo人参養栄湯投与実験における貧血モデル作製には、既報に基づき5フルオロウラシル(5FU)を用いた。5FU投与後3日目以降、蒸留水へ溶解した人参養栄湯を、4ヶ月齢のC57BL/6Jマウスへ経口投与した。投与量は1,000 mg/ kg body weightとし、2週間連日投与した。1週間おきに血液サンプルを採取し、自動血球計算装置で解析した。microRNA発現解析にはマウス骨髄より採取した単核球を人参養栄湯添加・未添加条件下で培養し、1・2・3日目に細胞を回収した。Total RNAを抽出・cDNA合成を行い、real time PCR法にはFAST SYBRGreen Master Mixを用い、Drosha及びDicer 1の遺伝子発現を評価した。

結果と考察

DNAマイクロアレイ法にて、人参養栄湯添加条件下での遺伝子発現の網羅的解析を行った。マウス骨髄単核球細胞培養11日後で、コントロール群に対して人参養栄湯添加群の遺伝子発現を比較した場合、発現亢進分子の中には、細胞表面受容体シグナル経路、転写、細胞周期関連分子等が、また発現低下分子は、サイトカイン受容体関連相互作用、DNA-dependent転写制御、アポトーシス制御関連分子等が含まれた。細胞の増殖・分化を制御するサイトカインはリガンドとして働き、特定の細胞表面受容体を介して細胞内シグナルを活性化後、最終的には転写因子を活性化し、標的遺伝子の発現を制御する。DNAマイクロアレイの結果より、人参養栄湯(または含有構成生薬)はマウス単核球では受容体を介したシグナル経路およびサイトカインシグナルを制御していること、転写制御を行うことが示唆された。本研究においては、人参養栄湯の細胞への取り込み機構の解明や、機能解析によるシグナル経路の同定には至っていないものの、得られたデータベースは作用機序の解明という点で大変有用だといえる。
DNAマイクロアレイの検証実験において、白血球造血を亢進するRasgrp1及びDok2 mRNAに関してin vitro, in vivoの発現結果が一致する結果ではなかった。貧血マウスモデルを用いたin vivo人参養栄湯投与実験では、既報と同様に赤血球数に加え、白血球数が増加した。特にBリンパ球造血に加え、マクロファージ造血が亢進したことを、各種マーカー発現および遺伝子発現レベルで示した点で本研究は新規性が高いと言える。

結論

In vitro添加培養実験系では、人参養栄湯の作用機序として、赤血球造血だけでなく白血球造血に関与するevidenceを分子生物学的手法により取得できた。Rasgrp１, Dok2 mRNAの発現結果に関してはin vitro実験では人参養栄湯の直接的効果検討の為、サイトカイン非添加に対し、in vivo実験ではマウス体内にサイトカイン等の活性物質が含まれるため、人参養栄湯以外の要因が影響し、その効果がマスクされた可能性が原因の一つとして考えられる。よって実験系(解析日数、培養条件、解析細胞等)の検討が必要だと考えられる。また、候補分子の関与するpathwayをin silico解析にて検討し、oxidativeリン酸化をはじめ、Wnt pathway、JAK-STAT pathway、Cytokine pathway等への関与が示唆されたことから、今後候補分子の機能解析を行うことで、さらに人参養栄湯の作用機序の解明が期待できる。貧血マウスモデルを用いたin vivo人参養栄湯投与実験から、in vivo投与実験系においても、人参養栄湯の作用機序に関するevidenceを分子生物学的手法により、一部であるが取得できた。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-09-30
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201208006B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 貧血用漢方薬の作用メカニズム解析と有効成分の同定
• 課題番号: H22-創薬総合-一般-006
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 杉山 大介(九州大学大学院医学研究院 先端医療医学部門先端医療医学講座造血幹細胞分野)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（創薬総合推進研究）
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　東洋漢方薬は2,000年以上にわたり、さまざまな疾患への治療に使用されてきた。日本においても漢方薬は臨床の場で患者へ投与されてきた。漢方薬は葉、花、芽、幹、枝や植物の茎由来の生薬の配合により調合される。配合することで、総合的な治療効果が得られ、個々の生薬の副作用は減少する。最近日本において、漢方医学は治療にしばしば使用されている。しかしながら血液学の分野においては、漢方薬の効果をもたらす分子メカニズムはほとんど明らかにされていない。
本研究では、これまで貧血用漢方薬の分子生物学的作用機序を解明し、現在までExperienceに基づき処方されてきた貧血用漢方薬のEvidenceを明らかにする事で、その医薬品としての地位を確立する事を目的とした。

研究方法

漢方薬の調整、骨髄細胞の単離と培養は総括概要に記載した。In vitroにおける細胞培養後、細胞カウントによる生細胞の評価後、フローサイトメトリーによる血球分化評価及び遺伝子発現を行い、赤血球造血・白血球造血・アポトーシスを検討した。さらに候補因子探索の為、DNAマイクロアレイ法、in silico解析を行った。検証実験として、in vitro, in vivoにて発現解析を行った。

結果と考察

平成22年度、マウス造血細胞へ貧血用漢方薬として代表的な四物湯類を添加培養し、細胞増殖を指標に赤血球系造血へ与える影響を検討した。その結果、人参養栄湯は細胞刺激因子非存在下で赤血球系造血を促進する事が明らかになった。平成23年度は、マウスにおける研究成果の蓄積と人参養栄湯の有効成分同定を試みた。マウス赤血球造血に加え、骨髄球造血を検討したところ、人参養栄湯は赤血球造血に加え、白血球造血を亢進する事が明らかになった。白血球造血亢進の機序は、抗アポトーシス効果と骨髄球分化促進による事も明らかになった。また、マウス骨髄単核球へ人参養栄湯を構成する生薬である地黄、当帰、白朮、他6成分を添加培養し、細胞増殖を検討したが、人参養栄湯と同様の増殖効果を認めなかった事より、人参養栄湯の効果は相助的である事が明らかになった。平成24年度は、マウスにおける研究成果の蓄積と人参養栄湯の有効成分同定を試みた。マウス赤血球造血に加え、骨髄球造血を検討したところ、人参養栄湯は赤血球造血に加え、白血球造血を亢進する事が明らかになった。白血球造血亢進の機序は、抗アポトーシス効果と骨髄球分化促進による事も明らかになった。また、マウス骨髄単核球へ地黄、当帰、白朮、他6成分を添加培養し、細胞増殖を検討したが、人参養栄湯と同様の増殖効果を認めなかった事より、人参養栄湯の効果は相助的である事が明らかになった。漢方薬が生薬単体ではなく配合剤として効果を発揮するEvidenceを得た成果は大きい。さらに、マイクロアレイ法にて人参養栄湯が影響を及ぼす遺伝子群の抽出を行った。人参養栄湯が造血へ与える増殖・分化効果に一致して、骨髄球造血へ影響を及ぼす因子を複数同定した。5FUを投与して人工的に汎血球減少状態を誘導したマウスへの人参養栄湯投与実験では、4週後白血球細胞の回復が認めら、それに伴いRasgrp1遺伝子等の遺伝子発現にも変化を認める事が明らかになった。

結論

　In vitroにおいては、マウス成体骨髄単核球細胞へ4種類の漢方薬を個別に添加後、細胞増殖数評価および細胞増殖を反映するc-Myc mRNAの発現解析を行った結果、サイトカイン非存在下において、人参養栄湯が有意に血液細胞増殖を亢進することが明らかとなった。その構成生薬の評価では、黄耆が最も血液細胞増殖を亢進したが、効果は相助的であった。増殖血液細胞を更に解析した結果、in vitro添加培養実験系では、人参養栄湯の作用機序として、赤血球造血だけでなく白血球造血に関与するevidenceを分子生物学的手法により取得できた。白血球造血亢進にはBcl-2 遺伝子発現を指標とした抗アポトーシス亢進への関与が認められた。人参養栄湯の作用機序を詳細に検討するために、DNAマイクロアレイ法による網羅的遺伝子発現解析を行った。発現制御が示唆された遺伝子のうち白血球造血を制御するRasgrp1, Dok2 遺伝子発現に関してin vitro人参養栄湯添加培養にて再現性が確認できたものの、in vivo人参養栄湯投与実験後のマウス骨髄細胞においては必ずしもin vitroの結果と一致せず、実験系の検討が必要だといえる。総じて、in vitro、in vivo両実験系においても、人参養栄湯の作用機序に関するevidenceを分子生物学的手法により、一部であるが取得できた。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-09-30
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201208006C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 人参養栄湯の添加により発現の上昇する4種類のmiRNAをマイクロアレイデータより抽出した。マウスの骨髄より採取した単核球をサイトカイン無の環境で、人参養栄湯添加有/無で5日間培養し、抽出したmiRNAの発現変動を見た。3種類は培養2日目にピークを示し、その後急激に減少した。1種類は培養3、4日目にピークを示した。
• 臨床的観点からの成果: miRNAの同定解析により、人参養栄湯添加により発現が上昇する遺伝子を数種類抽出した。現在、人参養栄湯を投与した患者血液より抽出したmiRNAの発現を解析中である。
• ガイドライン等の開発: 特になし。
• その他行政的観点からの成果: 漢方薬の作用メカニズムの解明は発展途上であった。現在までExperienceに基づき処方されてきた貧血用漢方薬に関して、本研究で貧血用漢方薬・人参養栄湯の作用メカニズムを分子レベルで一部Evidenceを明らかにした事で、その医薬品としての地位の確立・向上に一歩近づいた。
• その他のインパクト: 特になし。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 46件
• その他論文(和文): 3件
• その他論文(英文等): 12件
• 学会発表(国内学会): 25件
• 学会発表(国際学会等): 28件
• その他成果(特許の出願): 4件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: アセチル化酵素競合阻害因子Gm16515の新規用途
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2012-080211 ; 発明者名: 杉山 大介 准教授 （ 医学研究院） ; 権利者名: 九州大学 ; 出願年月日: 20120330 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 貧血患者の貧血の要因を検出するためのバイオマーカー
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: PCT/JP2013/072335 ; 発明者名: 杉山 大介 ; 権利者名: 九州大学 ; 出願年月日: 20130821 ; 国内外の別: 未定

• 特許の名称: CyclinD1遺伝子発現抑制剤および抗腫瘍剤
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: PCT/JP2014/054196 ; 発明者名: 杉山 大介 ; 権利者名: 九州大学 ; 出願年月日: 20140221 ; 国内外の別: 未定

• 特許の名称: 造血細胞の増殖ペプチド及びその用途
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 2014-070968 ; 発明者名: 杉山 大介 ; 権利者名: 株式会社 サイエンス・ラスター ; 出願年月日: 20140331 ; 国内外の別: 未定

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Sugiyama D, Sasaki T; Isolation of embryonic hematopoietic niche cells by flow cytometry and laser capture microdissection.; Methods Mol Biol. , 1035 , 57-65 (2013); 10.1007/978-1-62703-508-8_6.
• 原著論文2: Inoue-Yokoo T, Tani K, Sugiyama D.; Mesodermal and Hematopoietic Differentiation from ES and iPS Cells.; Stem Cell Rev. , 9 (4) , 422-434 (2013); 10.1007/s12015-012-9388-1.
• 原著論文3: Tan KS, Tamura K, Lai MI, et al; Molecular Pathways Governing Development of Vascular Endothelial Cells from ES/iPS Cells.; Stem Cell Rev. , 9 (5) , 586-598 (2013); 10.1007/s12015-013-9450-7.
• 原著論文4: Forrest AR, Kawaji H, Rehli M, Baillie JK, de Hoon MJ, Haberle V, Sugiyama D, et al; An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.; Nature , 507 (7493) , 455-461 (2014); 10.1038/nature12787.
• 原著論文5: FANTOM Consortium and the RIKEN PMI and CLST (DGT), Forrest AR, Sugiyama D, et al; A promoter-level mammalian expression atlas.; Nature , 507 (7493) , 462-470 (2014); 10.1038/nature13182.
• 原著論文6: Inoue T, Kulkeaw K, Muennu K, Tanaka Y, Nakanishi Y, Sugiyama D.; Herbal drug ninjin'yoeito accelerates myelopoiesis but not erythropoiesis in vitro.; Genes Cells , 19 (5) , 432-440 (2014); 10.1111/gtc.12143.
• 原著論文7: Arner E, Daub CO, Vitting-Seerup K, Andersson R, Lilje B,Sugiyama D, et al; Gene regulation. Transcribed enhancers lead waves of coordinated transcription in transitioning mammalian cells.; Science , 347 (6225) , 1010-1014 (2015); 10.1126/science.1259418
• 原著論文8: Tan KS, Inoue T, Kulkeaw K, Tanaka Y, Lai MI, Sugiyama D.; Localized SCF and IGF-1 secretion enhances erythropoiesis in the spleen of murine embryos.; Biol Open , 4 (5) , 596-607 (2015); 10.1242/bio.201410686
• 原著論文9: Kummalue T, Inoue T, Miura Y, Narusawa M, Inoue H, Komatsu N, Wanachiwanawin W, Sugiyama D, Tani K.; Ribosomal protein L11- and retinol dehydrogenase 11-induced erythroid proliferation without erythropoietin in UT-7/Epo erythroleukemic cells.; Exp Hematol , 43 (5) , 414-423 (2015); 10.1016/j.exphem.2015.01.006
• 原著論文10: Tanaka Y, Inoue-Yokoo T, Kulkeaw K, Yanagi-Mizuochi C, Shirasawa S, Nakanishi Y and Sugiyama D.; Embryonic hematopoietic progenitors cells reside in muscle before bone marrow hematopoiesis.; PLoS One , 10 (9) , e0138621- (2015); 10.1371/journal.pone.0138621
• 原著論文11: Collet G, Szade K, Nowak W, Klimkiewicz K, El Hafny-Rahbi B, Szczepanek K, Sugiyama D, et al; Endothelial precursor cell-based therapy to target the pathologic angiogenesis and compensate tumor hypoxia.; Cancer Letters , 370 (2) , 345-357 (2016); 10.1016/j.canlet.2015.11.008
• 原著論文12: Sasaki T, Sugiyama D,et al; Embryonic intra-aortic clusters undergo myeloid differentiation mediated by mesonephros-derived CSF1 in mouse; Stem Cell Reviews and Reports , 12 (5) , 530-542 (2016); 10.1007/s12015-016-9668-2
• 原著論文13: Swain A, Kulkeaw K, Tanaka Y, Nakanishi Y, Shirasawa S, Sugiyama D.; DBA Lectin Binds to Highly Proliferative Mouse Erythroleukemia Cells; Anticancer Research , 36 (7) , 3625-3633 (2016); 10.1007/s12015-016-9668-2
• 原著論文14: Milne CP, Mittra J, Kojima N, Sugiyama D, Awatin J, Simmons G; Prospects for Harmonizing Regulatory Science Programs in Europe, Japan, and the United States to Advance Regenerative Medicine.; Therapeutic Innovation & Regulatory Science , 50 (6) , 724-733 (2016); 10.1177/2168479016650716
• 原著論文15: Sugiyama D, Joshi A, Kulkeaw K, Tan K.S, Yokoo-Inoue T, Mizuochi-Yanagi C, et al; A Transcriptional Switch Point During Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Ontogeny.; Stem Cells Dev, , 26 (5) , 314-327 (2017); 10.1089/scd.2016.0194
• 原著論文16: Hoong L.K, Mahdzir M.A, Din M.F, Awang K, Tanaka Y, Kulkeaw K, Ishitani T, Sugiyama D.; Induction of intrinsic apoptosis in leukaemia stem cells and in vivo zebrafish model by betulonic acid isolated from Walsura pinnata Hassk (Meliaceae); Phytomedicine , 26 , 11-21 (2017); 10.1016/j.phymed.2016.12.018

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-27
• 更新日: 2017-06-01

収支報告書

• 文献番号: 201208006Z