プロテオーム解析による糖尿病性細小血管症の早期診断マーカーの探索

文献情報

• 文献番号: 201207001A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: プロテオーム解析による糖尿病性細小血管症の早期診断マーカーの探索
• 課題番号: H20-バイオ-一般-009
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 春日 雅人(独立行政法人国立国際医療研究センター 研究所)

研究分担者(所属機関)

• 野田　光彦(独立行政法人国立国際医療研究センター　病院)
• 鏑木　康志(独立行政法人国立国際医療研究センター　研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（創薬バイオマーカー探索研究）
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 25,110,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

近年急増している糖尿病の特徴は慢性的な経過で糖尿病性細小血管症を合併することであり、その進行と共に失明、腎不全、下肢切断等の重篤な合併症を引き起こす。これらの合併症の予防及び治療は代謝疾患罹患患者のQOL及び生存率向上のために非常に重要であり、日常診療の現場でその病期や予後・進行性等を診断可能なバイオマーカーが開発されればその意義は高い。本研究は糖尿病の日常診療の場で糖尿病性細小血管症の有無・予後を血液・尿から簡便に判定可能なバイオマーカー開発を目的とし、2型糖尿病患者並びに糖尿病性細小血管症を呈する2型糖尿病患者より血清、尿検体を収集し、これらの臨床検体を用いたプロテオーム・ペプチドーム解析により糖尿病性細小血管症に関連する蛋白質・ペプチドの探索を行った。

研究方法

国立国際医療研究センター病院・国府台病院、富山大学附属病院、ＪＲ東京総合病院に通院、入院する2型糖尿病患者から血清ならびに随時尿検体の収集を行った。さらに、非糖尿病対照群として本施設人間ドック受診者より血清、随時尿検体を収集した。また、検体を収集した患者については糖尿病性細小血管症を含めた臨床情報の収集も併せて行った。血清プロテオーム解析は2型糖尿病モデルマウスKK-Ayマウス血清を対象とし、iTRAQ法によるnon-targeted proteomics解析を行った。尿プロテオーム解析はヒト2型糖尿病患者随時尿検体を対象とし、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動法、非標識定量法を用いた定量的プロテオミクス解析により探索を行った。網羅的な探索により得られた多数の候補蛋白質の中から糖尿病性細小血管症の関連マーカーの発現変動を検証するために、targeted proteomicsの一手法であるmultiple reaction monitoring (MRM)法による定量解析法を確立し、多項目一斉定量分析を行った。検証された蛋白質群と糖尿病腎症との関連は重回帰分析、receiver-operating characteristic解析により評価した。人間ドック受診者の血清Leukocyte cell-derived chemotaxin 2 (LECT2)濃度の測定はELISA法により行った。

結果と考察

研究期間内に、本施設をはじめとする4医療機関から糖尿病患者約1000例、健常者約600例の血清、随時尿検体ならびに付随する臨床情報の収集を行い、ほぼ目標を達成することが出来た。糖尿病性細小血管症の早期診断マーカーの探索として、KK-Ayマウス血清を対象とした標識定量法を用いた定量的プロテオミクス解析を行った。解析の結果、糖尿病の発症早期より関連する蛋白質群の同定に成功し、その内の一蛋白質であるserine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 3 (SERPINA3)が網膜微小血管内皮細胞の細胞透過性を亢進することにより糖尿病性網膜症の発症・進展に関与する可能性を見出した。肝臓で産生される血中タンパク質Leukocyte cell-derived chemotaxin 2(LECT2)はその機能の一つとして抗炎症性作用を持つことが推測されている。血中LECT2濃度と各種臨床指標との関連を検討する目的で、人間ドック受診者231人の血清サンプルを使って肥満および脂肪肝とLECT2との関連を解析した。血清LECT2濃度は肥満および脂肪肝と正の相関を示し、LECT2の肥満関連因子としての新たな役割を見出した。ヒト尿検体を用いて糖尿病ならびに糖尿病腎症の発症・進展を早期に予測する関連因子の探索を行った。蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動法や非標識法を用いた定量プロテオミクス解析システムを用いて早期腎症患者尿中で発現変動する蛋白質群の同定に成功した。同定した蛋白質群は独立した検体を用いたMRM定量解析でも糖尿病腎症との関連が検証され、その中には現在までに糖尿病腎症との関連が明らかにされていない蛋白質も含まれていた。

結論

2型糖尿病の発症早期より関連する血清蛋白質群を同定し、その内SERPINA3は網膜微小血管内皮細胞の細胞透過性を亢進することにより糖尿病性網膜症の発症・進展に関与する可能性を示した。さらに尿検体を用いた解析でも糖尿病腎症の早期から関連するタンパク質を効率よく同定することに成功し、この中にはこれまでに糖尿病との関連が報告されていない新たな早期診断マーカー候補も含まれていた。本研究により糖尿病性細小血管症の早期診断に有用なマーカー候補を絞り込むことが可能となり、これらの成果を発展させて信頼性の高い早期診断法が確立されれば糖尿病患者のQOL向上及び医療費節減のために有効な手段となることが期待される。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-09-04
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201207001B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: プロテオーム解析による糖尿病性細小血管症の早期診断マーカーの探索
• 課題番号: H20-バイオ-一般-009
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 春日 雅人(独立行政法人国立国際医療研究センター 研究所)

研究分担者(所属機関)

• 野田　光彦(独立行政法人国立国際医療研究センター　病院)
• 鏑木　康志(独立行政法人国立国際医療研究センター　研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究（創薬バイオマーカー探索研究）
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

糖尿病患者は国内外で急増しており、2012年の国際糖尿病連合報告によると世界の糖尿病有病数は3億7100万人と全人口の8.3%を占めている。日本においても近年、糖尿病を含む生活習慣病は急激しており，厚生労働省の2007年国民健康・栄養調査では糖尿病有病者は890万人といわれ、5年前の調査と比較しても20％以上増加している。糖尿病の特徴は慢性的な経過で糖尿病性細小血管症を合併することであり、その進行と共に失明、腎不全、下肢切断等の重篤な合併症に至ることもあり、国民健康上大きな問題になっている。一方、これらの糖尿病性細小血管症は重篤な合併症が進行するまで自覚症状を伴わないため日常診療の現場で病期の変化を把握することが重要であるが、信頼すべき代謝マーカーが乏しく、糖尿病性細小血管症の病期や予後・進行性などを診断可能な診断指標（バイオマーカー）が開発されればその意義は高い。そこで本研究は糖尿病性細小血管症の早期診断マーカー開発を目的として、2型糖尿病患者、ならびに糖尿病性細小血管症を呈する2型糖尿病患者より血清、尿検体を収集し、これらの臨床検体を用いたプロテオーム・ペプチドーム解析により糖尿病性細小血管症に関連する蛋白質・ペプチドの探索を行った。

研究方法

国立国際医療研究センター病院・国府台病院、富山大学附属病院、ＪＲ東京総合病院に通院、入院する2型糖尿病患者からの血清、ならびに随時尿検体の収集を開始した(目標1200人)。さらに、非糖尿病対照群として国立国際医療研究センター病院人間ドック受診者より血清、随時尿検体を収集した(目標600人)。また、検体を収集した患者については糖尿病性細小血管症を含めた臨床情報の収集も併せて行った。
糖尿病性細小血管症の早期診断マーカーの探索にあたっては疾患モデル動物や臨床検体から得られた血清、ならびに尿を探索対象とし、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動法や標識/非標識定量法を用いた定量的プロテオミクス解析により探索を行った。また、網羅的な探索の結果得られた多数の候補タンパク質の中から糖尿病性細小血管症の関連マーカーを選出するために、targeted proteomicsの一手法であるmultiple reaction monitoring (MRM)法による定量解析法を確立し、多項目一斉定量分析を行った。

結果と考察

本研究期間内に、本施設をはじめとする4医療機関から糖尿病患者　約1000例、健常者　約600例の血清、随時尿検体を収集した。併せて付随する臨床情報の収集を行い、ほぼ目標を達成することが出来た。
Non-targeted、およびtargeted proteomicsを組み合わせた血清を対象とする解析の成果としては、網膜微小血管内皮細胞の透過性を調節し糖尿病性網膜症の発症・進展への関与が推測される蛋白質をはじめとする2型糖尿病関連蛋白質の同定が挙げられる。また、肝臓で産生され抗炎症性作用を持つことが知られるLeukocyte cell-derived chemotaxin 2 (LECT2)と各種臨床指標との関連解析の結果、血清LECT2濃度は肥満および脂肪肝と正の相関を示し、LECT2の肥満関連因子としての新たな役割を見出した。
一方、ヒト尿検体を用いて糖尿病、ならびに糖尿病腎症の発症・進展を早期に予測する関連因子の探索を行った。蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動法に加え、新しいショットガンプロテオミクスの解析法として非標識法を用いた定量プロテオミクス解析システムを取り入れた。本システムでは検体に含まれる全タンパク質の質量電荷比と溶出時間、ピーク強度を取得することにより、発現変動タンパク質群のより網羅的な解析、ならびに発現変動を示す低濃度タンパク質群の効率的な同定が可能となった。同定した複数の蛋白質は独立した検体を用いたMRM定量解析でも糖尿病腎症との関連が検証され、その中には現在までに糖尿病腎症との関連が明らかにされていない蛋白質も含まれていた。

結論

本研究により糖尿病性細小血管症の早期診断に有用なマーカー候補を絞り込むことが可能となった。これらの成果を発展させて信頼性の高い早期診断法が確立されれば糖尿病患者のＱＯＬ向上及び医療費節減のために有効な手段となることが期待される。また、本研究では、約1000例の糖尿病患者から糖尿病細小血管症の有無、重症度を含む臨床情報、臨床検体を収集しており、糖尿病細小血管症バイオマーカー探索のための詳細な解析が可能である。このようなパネルは国内外に関わらず存在しないため、この患者集団を追跡調査することによって今後の糖尿病細小血管症バイオマーカー検証のための多様な用途に耐える貴重な研究資源となると思われる。

公開日・更新日

• 公開日: 2013-09-04
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201207001C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 国立国際医療研究センターを含む4施設より2型糖尿病(T2DM)患者1055名、非T2DM対照者651名の血清、尿検体を収集し、非標識定量プロテオーム解析法にて糖尿病腎症に関連する尿蛋白質33種の同定と、そのうち9蛋白質が早期腎症の判別に有効であることを示した。KK-Ayマウスの血清プロテオーム解析では、前糖尿病状態より発現上昇する蛋白質SERPINA3を同定した。SERPINA3はヒトT2DM患者血清でも高値を示し、血管内皮細胞の細胞透過性亢進に寄与することから、病態形成との関連が想定される。
• 臨床的観点からの成果: 近年急増している糖尿病の特徴は慢性的な経過で糖尿病性細小血管症を合併することであり、その進行と共に失明、腎不全、下肢切断等の重篤な合併症を引き起こすことによって、国民健康上大きな問題になっている。現時点では、糖尿病の日常診療の場で糖尿病性細小血管症の有無あるいは予後を血液あるいは尿から簡便に判定可能なバイオマーカーは存在しないが、本研究による成果はこれらの合併症の予防、早期診断、早期治療に寄与する可能性がある。
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: なし
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 1件
• 原著論文（英文等）: 50件
• その他論文(和文): 4件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 24件
• 学会発表(国際学会等): 2件
• その他成果(特許の出願): 5件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: 糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法及びキット
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願 2013-173382 ; 発明者名: 鏑木 康志、久保田 浩之、高倉 美智子 ; 出願年月日: 20130823 ; 国内外の別: 国内

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Takahashi E, Okumura A, Unoki-Kubota H,et al.; Differential proteome analysis of serum proteins associated with the development of type 2 diabetes mellitus in the KK-Ay mouse model using the iTRAQ technique.; J Proteomics , 84 , 40-51 (2013); 10.1016/j.jprot.2013.03.014.
• 原著論文2: Okumura A, Unoki-Kubota H, Matsushita Y, Shiga T,et al.; Increased serum leukocyte cell-derived chemotaxin 2 (LECT2) levels in obesity and fatty liver.; BioScience Trends , 7 , 276-283 (2013)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-27
• 更新日: 2017-06-22

収支報告書

• 文献番号: 201207001Z